血清GP73對原發(fā)性肝癌診斷的實驗研究.pdf

1、背景：
　　 原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是在世界范圍發(fā)病率較高的惡性腫瘤。PHC由肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞型肝癌組成。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)已成為一個主要的健康問題，在2002年全世界新增62.6萬患者，排名在第六位。HCC在我國消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病中居第3位，在我國肝細(xì)胞癌居惡性腫瘤死亡率的第二位。膽管細(xì)胞型肝癌(intrahepatic

2、cholangiocarcinoma，ICCA)是來源于不同膽管細(xì)胞的上皮癌，約占膽管細(xì)胞癌10％。進(jìn)展型的膽管細(xì)胞型肝癌有很差的預(yù)后，其存活的中位數(shù)<24個月。根治性治療有外科切除和肝臟移植，但是大部分患者都是在進(jìn)展期被發(fā)現(xiàn)的，很難進(jìn)行外科手術(shù)。
　　 甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是現(xiàn)在較好的一個在肝硬化患者中被推薦檢測HCC的血清標(biāo)志物[1]。由于它的敏感度只有39—64％，特異度為76—91％[2

3、-4]，AFP并不是一個理想的篩選檢測指標(biāo)。
　　 糖鏈抗原19-9(Carbohydralte antigen19—9，CA199)是在診斷膽管細(xì)胞型肝癌中使用最廣泛的。CA199對膽管細(xì)胞型肝癌并不具有特異性。CA199在胰腺癌、直腸癌、胃癌和婦科惡性腫瘤中升高。在與非原發(fā)性硬化性膽管炎患者比較鑒別中，以血清CA199超過100U/mL為標(biāo)準(zhǔn)，診斷膽管細(xì)胞癌敏感度為53％。因此，膽管細(xì)胞型肝癌的診斷需要尋找更好的血清學(xué)標(biāo)志物

4、。
　　 高爾基蛋白73(Golgi protein-73，GP73)是一個新認(rèn)識的HCC血清標(biāo)志物。GP73在很多組織的正常上皮細(xì)胞表達(dá)。它的功能還不清楚。在分離出的正常肝細(xì)胞中GP73是減少或則正常表達(dá)，但是在病毒和非病毒肝疾病的肝細(xì)胞[5]和HCC[5]是上調(diào)的。這表明GP73可能作為一個潛在的早期檢測HCC標(biāo)志物。
　　 基于它在肝臟疾病的表現(xiàn)和GP73在亞洲人尤其中國人的HCC研究較少，而且在膽管細(xì)胞型肝癌中尚

5、未見研究。本研究探討GP73蛋白能否在中國肝臟病患者及胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌患者和健康人對照組血清中檢測到并比較，比較HCC的血清GP73蛋白和AFP，ICCA的血清GP73蛋白和CA199。同時采用nested PCR方法檢測肝臟病患者的血清GP73 mRNA情況。
　　 方法：
　　 1蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測GP73蛋白的表達(dá)
　　 實驗分為9組，乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌組、慢性乙型

6、肝炎組和健康人對照組各31例，乙肝相關(guān)性肝硬化組20例，另外膽管細(xì)胞型肝癌13例，胃癌組、結(jié)腸癌組、乳腺癌組各10例，胰腺癌組6例。從各實驗對象抽取外周靜脈血5ml，測定出樣品的蛋白質(zhì)含量，然后將蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳，加入一抗，二抗，染色，轉(zhuǎn)膜觀察結(jié)果。在每塊膠上有一已知標(biāo)準(zhǔn)血清，結(jié)果為標(biāo)本血清值與標(biāo)準(zhǔn)值的比較。
　　 2多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片監(jiān)測系統(tǒng)檢測AFP和CA199
　　 實驗分為9組，與實驗第一部分相同。各

7、組均采集空腹靜脈血3ml，離心，分離血清，操作過程嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。
　　 3巢式逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(nested PCR)法檢測GP73 mRNA的表達(dá)
　　 實驗分為5組，乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌組、慢性乙型肝炎組和健康人對照組各31例，乙肝相關(guān)性肝硬化組20例，另外膽管細(xì)胞型肝癌13例。根據(jù)Genbank人類GP73 cDNA序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer5設(shè)計引物。從五組各實驗對象抽取外周靜脈血0.5ml，立

8、即離心后提取血清，進(jìn)行RNA提取，定量后以其為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，然后用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，GP73 mRNA的表達(dá)量通過與內(nèi)對照光密度的比較來判斷。使用凝膠影像系統(tǒng)和Ouantity One分析。
　　 結(jié)果：
　　 1血清GP73蛋白能在各組中檢測得到，在乙肝相關(guān)性肝癌中表現(xiàn)最高。胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和胰腺癌血清中的GP73蛋白和健康人比較略有升高但無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2

9、測得肝細(xì)胞癌患者組GP73蛋白為20.50±12.13相對單位。肝細(xì)胞癌GP73的ALIROC是0.79(95％CI：0.66—0.92)，其敏感度為77.4％，特異度為80.％，它的最佳截斷值為8.3相對單位。而肝細(xì)胞癌AFP的AUROC為0.64(95％CI：0.48-0.79)，敏感度為61.3％，特異度為75.0％，最佳截斷值是20.97μg/L。在肝細(xì)胞癌中ROC曲線下面積、敏感度和特異度GP73蛋白要優(yōu)于AFP。
　　

10、 3測得膽管細(xì)胞型肝癌血清GP73蛋白為14.22±9.92相對單位，AUROC為0.67(95％CI：0.47-0.87)，敏感度為61.5％，特異度為85.0％，最佳截斷值為9.1相對單位。膽管細(xì)胞型肝癌CA199的AUROC是0.38(CI：0.15-0.60)，敏感度為23.1％，特異度為95.0％，最佳截斷值是364.82U/ml。膽管細(xì)胞型肝癌ROC曲線下面積、敏感度GP73蛋白要優(yōu)于CA199。血清GP73聯(lián)合CA199

11、診斷膽管細(xì)胞型肝癌的敏感度為70.4％，特異度為80.8％。
　　 4肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞型肝癌共同組成原發(fā)性肝癌，其血清GP73為18.65±11.77相對單位、AFP為99.55±139.51 ng/ml。本研究中膽管細(xì)胞型肝癌AFP與正常對照組無差異；而膽管細(xì)胞型肝癌血清GP73要明顯高于正常對照組，而在其他腫瘤中血清GP73也未見明顯升高。
　　 5對各肝臟疾病組血清使用nested PCR進(jìn)行GP73 mRNA定

12、性檢測，能檢測得到GP73 mRNA。肝細(xì)胞癌組在各組中表達(dá)最高，其GP73 mRNA的表達(dá)率為93.5％(29/31)，但正常人的表達(dá)率有45.2％。
　　 結(jié)論：
　　 1 GP73蛋白在患肝臟疾病中國人中能檢測得到，在乙肝相關(guān)性肝癌中表達(dá)最高，在胃癌，結(jié)腸癌，乳腺癌和胰腺癌中GP73不升高。
　　 2肝細(xì)胞癌血清GP73蛋白通過ROC曲線與AFP比較，血清GP73敏感度和特異度及曲線下面積要優(yōu)于AFP。因此

13、血清GP73蛋白有可能作為代替AFP的肝細(xì)胞癌的血清腫瘤標(biāo)志物。
　　 3膽管細(xì)胞型肝癌血清GP73蛋白通過ROC曲線與CA199比較，血清GP73敏感度曲線下面積要優(yōu)于CA199。因此血清GP73蛋白是優(yōu)于CA199診斷膽管細(xì)胞型肝癌的血清腫瘤標(biāo)志物。血清GP73聯(lián)合CA199診斷膽管細(xì)胞型肝癌敏感度會進(jìn)一步提高。
　　 4膽管細(xì)胞型肝癌血清GP73較正常人明顯升高，但血清AFP與正常人比較無差異，因此原發(fā)性肝癌血清G