共刺激分子mRNA表達水平與衰老及腫瘤關(guān)系的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建含共刺激分子CD28、CTLA-4、CD86、CD40L、ICOS、ICOSL等目的基因片段的重組質(zhì)粒標準品，建立檢測這些共刺激分子mRNA表達水平的Taqman探針實時熒光定量PCR方法。并檢測上述共刺激分子在不同年齡段健康人及癌癥患者中的表達情況，探討共刺激分子與衰老及腫瘤的關(guān)系。
　　 方法：第一部分：以從一例組織（胃腺癌）中提取的總RNA為模板、Random9 mers為引物反轉(zhuǎn)錄合成c1NA，用該cDNA為模

2、板PCR擴增人CD28、CTLA-4、CD86、CD40L、ICOS、ICOSL的目的基因表達片段，構(gòu)建PBS-TⅡ/CD28/CTLA-4/CD86/CD40L ICOS/ICOSI/β-ACTIN重組質(zhì)粒，鑒定測序后，用Taqman探針熒光定量PCR制作標準曲線。
　　 第二部分：收集165例（20-88歲）健康人外周血標本，按不同年齡段分為6組，采用實時熒光定量PCR技術(shù)的方法檢測共刺激分子CD28、CTLA-4、CD86

3、、CD40L、ICOS、ICOSL mRNA在不同年齡段健康人群外周血的表達量并進行比較，以探討共刺激分子與衰老的關(guān)系。
　　 第三部分：采用實時熒光定量PCR技術(shù)的方法檢測共刺激分子CD28、CTLA-4、ICOS、ICOSLmRNA在食管癌及肺癌患者外周血的表達量，并檢測比較ICOS/ICOSLmRNA在胃腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織的表達量。
　　 結(jié)果：第一部分：組織提取的總RNA完整性良好，構(gòu)建的CD28、CTLA4

4、、CD86、CD40L、ICOS、ICOSI，重組質(zhì)粒測序結(jié)果與目的片段一致，原始質(zhì)粒標準品倍比稀釋后用Taqman探針熒光定量PCR檢測，CTLA-4、CD86質(zhì)粒標準品在E12-E4copies/mL，CD28、CD40L、ICOS、ICOSL，質(zhì)粒標準品在E12-E3 copies/mL線性關(guān)系良好（R2=1）。
　　 第二部分：（1）各年齡段中不同性別的每種共刺激分子的mRNA表達量比較無統(tǒng)計學(xué)意義。（2）健康人外周血中

5、CD28、ICOS mRNA的表達水平隨著年齡的增加降低，而CTLA-4 mRNA表達情況則相反。（3）健康人外周血中CD86、CD40L、ICOSImRNA的表達水平與年齡無相關(guān)性（P>0.05）。
　　 第三部分：（1）51-70歲年齡段的食管癌及肺癌患者外周血中CD28、ICOS、CTLA-4mRNA的表達水均低于健康人。（2）胃腺癌組織中ICOS mRNA表達水平低于相應(yīng)癌旁組織。（3）CD28、CD40L、ICOS、I

6、COSLmRNA的表達量在不同臨床分期、癌的類型、分化程度及有無淋巴轉(zhuǎn)移等的分組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：1.成功建立Taqman探針實時熒光定量檢測CD28、CTLA-4、CD86、CD40L、ICOS、ICOSL，基因表達的方法。
　　 2.隨著年齡增加共刺激分子基因表達水平的變化可能與衰老的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。
　　 3.癌癥患者外周血或組織中活化性共刺激分子基因表達水平的降低，可能是腫瘤