中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護作用及機制.pdf

1、研究背景:
　　急性腎損傷（Acute Kidney Injury，AKI）是危重病人常見的一組并發(fā)癥。在發(fā)展中國家及發(fā)達國家都非常普遍，因其具有高的發(fā)病率及死亡率，因此危害極大[1]。急性腎損傷通常發(fā)生在各種大手術后及危重病人中。據(jù)報道稱有36％的ICU病人并發(fā)AKI。盡管嘗試了各種方法來預防、緩解AKI的發(fā)生，但效果仍不理想，死亡率高、住院天數(shù)延長、治療費用增加這些問題依舊突出[2]。動物實驗中，偶然發(fā)現(xiàn)可以早期在尿中快速檢測

2、到中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白（NGAL），因此引起了人們研究將NGAL作為AKI病人非侵入性指標的興趣。血、尿NGAL水平與AKI病人血肌酐水平、腎活檢結(jié)果相關。使用免疫組化技術觀察到AKI病人在皮質(zhì)腎小管區(qū)有大量NGAL表達。隨后，越來越多的臨床試驗也證實了NGAL可作為診斷各臨床背景下AKI發(fā)生的一個早期指標[3]。然而除了將其作為早期診斷AKI的生物指標外，越來越多的證據(jù)表明NGAL在缺血再灌注腎損傷過程中也發(fā)揮著一定的保護

3、作用。國外學者通過建立小鼠缺血再灌注損傷
　?。↖schemia/Reperfusion，I/R）模型，檢測外源性NGAL蛋白對I/R腎損傷的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予外源性NGAL蛋白治療組的小鼠較模型組腎功能得到了明顯的改善，腎小管上皮細胞凋亡數(shù)量減少。凋亡是急性腎損傷發(fā)生后腎小管上皮細胞重要的死亡形式。目前，關于NGAL蛋白參與I/R腎損傷凋亡過程的機制研究較少，本課題擬通過建立大鼠缺血再灌注損傷模型，觀察外源性NGAL蛋白對I/

4、R腎損傷的抗凋亡保護作用及相關機制。
　　研究目的:
　　通過建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型觀察外源性中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白（NGAL）對大鼠急性腎損傷的保護作用及機制。
　　研究方法:
　　首先建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型：將一側(cè)腎蒂結(jié)扎并予以切除，之后用無創(chuàng)動脈夾夾閉對側(cè)腎蒂45 min。將30只成年雄性Sprague-Dawley大鼠按照隨機分組原則分為三組，每組各10只，分別為對照組，缺血再灌

5、注組和缺血再灌注給藥組。術前藥物準備：用2ml滅菌蒸餾水溶解50μg重組大鼠NGAL蛋白，分四次（0.5ml/次）經(jīng)缺血再灌注給藥組大鼠尾靜脈注入，即缺血前30 min、缺血中及缺血后30、60 min，對照組與缺血再灌注組于相同時間點給予相同劑量（0.5ml）的0.9%氯化鈉注射液。全自動生化分析儀檢測再灌注24 h后大鼠的血清肌酐
　?。⊿cr）和血尿素氮（Bun）水平；蘇木精-伊紅（HE）染色光鏡下觀察腎臟的形態(tài)學改變；TU

6、NEL染色檢測各組腎小管上皮細胞的凋亡情況；免疫組織化學染色及Western blot技術檢測活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CC3）及B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白（Bax）表達；實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction）技術檢測各組大鼠Bax mRNA水平的變化。
　　研究結(jié)果:
　?。?）腎功能：再灌注24 h后，缺血再灌注組的Scr水平為（121.857±17.15

7、1）μmol/L，顯著高于對照組及缺血再灌注給藥組的（24.000±3.829）及（63.400±11.908）μmol/L（P值均　?。?

8、）HE染色：光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，給予外源性NGAL蛋白治療組的腎臟損傷情況較缺血再灌注組顯著減輕，對照組腎臟結(jié)構(gòu)清晰。
　?。?）TUNEL染色：TUNEL染色陽性細胞主要見于腎小管上皮細胞。對照組及缺血再灌注給藥組的凋亡細胞數(shù)分別為1.800±0.837個/高倍視野及7.800±1.924個/高倍視野，均顯著低于缺血再灌注組的15.400±3.049個/高倍視野（P值均<0.05）。
　?。?）免疫組織化學染色與圖像半定量分析

9、：對照組的CC3和Bax蛋白陽性表達率分別為（0.608±0.148）%、（3.716±0.482）%，缺血再灌注給藥組的CC3和Bax蛋白陽性表達率分別為（3.171±0.321）%、（7.440±1.640）%，均顯著低于缺血再灌注組的（7.291±1.059）%、（15.456±1.955）%（P值均<0.05）。
　?。?）Western Blot：對照組的CC3及Bax的蛋白表達分別為0.104±0.029及0.155±

10、0.027,；缺血再灌注給藥組的CC3及Bax蛋白表達分別為0.284±0.066及0.346±0.055，均顯著低于缺血再灌注組，0.409±0.073及0.443±0.041（P值均<0.05）
　?。?）Real-time PCR：缺血再灌注給藥組的Bax mRNA表達明顯低于缺血再灌注組（1.423±0.187 VS2.550±0.217，P值<0.05），但兩者均高于對照組的Bax mRNA表達（1.000±0.000，