ENU誘變瞳孔散大小鼠模型的分子機(jī)制與遺傳特性研究.pdf

1、乙烷亞硝基脲(ethylnitrosourea，ENU)是一種能夠引起基因高效突變的烷化劑，通過(guò)使用ENU誘導(dǎo)小鼠突變的手段，經(jīng)過(guò)篩選可獲得大量具有突變表型的G1代小鼠，用于基因功能的研究及人類疾病動(dòng)物模型的建立。
　　 通過(guò)ENU誘導(dǎo)小鼠突變，我們獲得一種瞳孔散大小鼠，研究發(fā)現(xiàn)該突變表型是由Nrg1基因突變引起，藥理及免疫組化實(shí)驗(yàn)表明該突變導(dǎo)致小鼠瞳孔括約肌上M受體減少。該小鼠被命名為Nrg1m1Yzcm（neuregulin

2、 1;mutation 1，Yangzhou University Comparative Medicine Center,hereafter Dp1）。遺傳實(shí)驗(yàn)表明突變雜合子小鼠瞳孔散大表型外顯率極低，而純合子小鼠外顯率為100％。本研究工作分為以下五個(gè)部分:
　　 1、ENU誘變獲得一種瞳孔散大小鼠
　　 通過(guò)ENU誘導(dǎo)小鼠突變手段獲得一種瞳孔部分散大雜合子小鼠，當(dāng)用光線照射小鼠眼球時(shí)，該小鼠瞳孔對(duì)光線無(wú)明顯反射現(xiàn)象

3、（無(wú)明顯收縮）。
　　 將瞳孔散大雜合子小鼠與正常B6小鼠配種后共觀察并記錄115只后代小鼠，其中3只小鼠出現(xiàn)單側(cè)且部分瞳孔散大表型;將瞳孔散大雜合子互交，觀察并記錄34只后代，共有5只后代小鼠表現(xiàn)為瞳孔散大表型，其中1只小鼠表現(xiàn)為單側(cè)且部分瞳孔散大表型，4只小鼠表現(xiàn)為雙側(cè)且嚴(yán)重瞳孔散大表型;4只雙側(cè)且嚴(yán)重瞳孔散大表型小鼠互交后代全部表現(xiàn)為瞳孔散大表型。
　　 2、瞳孔散大突變基因的定位
　　 在初步染色體定位過(guò)

4、程中，采用B6背景瞳孔散大突變小鼠與C3H或D2小鼠配種獲得的F1代小鼠，并將F1代小鼠與B6背景野生型小鼠回交獲得的N2代突變小鼠配種方案繁殖用于定位小鼠。定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)在25個(gè)N2瞳孔散大小鼠樣品中突變基因與微衛(wèi)星D8mit171（距著絲粒11.43cM）和D8mit4(距著絲粒18.89cM)均未發(fā)生交換，從而確定該突變基因位于小鼠第8號(hào)染色體D8mit171和D8mit4之間（或附近）。另外突變基因與其他染色體上所選微衛(wèi)星均無(wú)明顯

5、連鎖。
　　 由于以上配種方案獲得具有突變表型的N2代小鼠的外顯率極低。在精確定位過(guò)程中改用將瞳孔散大突變小鼠與D2或C3H小鼠配種得到F1代，再將F1代小鼠互交獲得F2代突變小鼠方案進(jìn)行定位。結(jié)果共獲得118只F2代突變小鼠，最終將瞳孔散大突變基因定位于遺傳標(biāo)記rs32829041（單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記）與D8Mit4之間，兩標(biāo)記間距離約1.52Mb。在此區(qū)間目前已報(bào)道Dusp26，Rnf122，BC019943,Mak16,F

6、ut10,7420700N18Rik,Snord13,Mir1186,Nrg1共9種基因，但無(wú)相關(guān)基因突變引起瞳孔散大異常表型的相關(guān)報(bào)道。
　　 3、瞳孔散大突變基因的克隆與序列分析
　　 對(duì)上述9種基因分別進(jìn)行測(cè)序分析。序列比對(duì)結(jié)果顯示Dusp26、Mir1186、Rnf122、Snord13、BC019943、Mak16、Fut10、7420700N18Rik序列與數(shù)據(jù)庫(kù)或本中心B6小鼠相應(yīng)基因序列一致，基本排除這些

7、基因的突變引起Dp1小鼠瞳孔散大表型的可能。在對(duì)Nrg1基因測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)在Nrg1外顯子E59（該外顯子編碼NRG1蛋白EGFβ結(jié)構(gòu)域）后第5個(gè)堿基處發(fā)生G到A的轉(zhuǎn)換。
　　 由于瞳孔散大小鼠G到A的堿基突變位于mRNA剪接供體位點(diǎn)，推測(cè)該突變可能影響剪接體對(duì)該位點(diǎn)剪接能力，從而引起Dp1小鼠瞳孔散大表型。為了證實(shí)以上設(shè)想，設(shè)計(jì)分別擴(kuò)增Ig及CRD型Nrg1局部序列的引物（擴(kuò)增區(qū)域包含突變位點(diǎn)）。通過(guò)RT-PCR方法，分別從瞳

8、孔散大及野生型B6小鼠腦組織總RNA中擴(kuò)增相應(yīng)片段，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果顯示對(duì)瞳孔散大及野生型B6小鼠Ig及CRD型Nrg1基因分別擴(kuò)增出3個(gè)條帶(banda、bandb、bandc)。其中bandb對(duì)應(yīng)于β1-typeEGFNrg1，該類型Nrg1在大腦中高度表達(dá)。定量分析結(jié)果表明與野生型小鼠相比突變純合子小鼠Nrg1的CRD及Ig型Nrg1中bandb基因表達(dá)量?jī)H分別為野生型小鼠的42.6％和32.8

9、％。
　　 對(duì)野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型條帶a直接測(cè)序表明:野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型4種a條帶測(cè)序信號(hào)圖都出現(xiàn)明顯的重疊信號(hào)。對(duì)野生型B6小鼠Ig型及CRD型b條帶直接測(cè)序表明:所測(cè)序列測(cè)序信號(hào)無(wú)明顯重疊，序列分別對(duì)應(yīng)于CRD-β1和Ig-β1Nrg1基因序列，而對(duì)瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型條帶b測(cè)序都出現(xiàn)明顯的重疊信號(hào)。對(duì)野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型c條帶測(cè)序結(jié)果表明:1）野生型B6

10、和瞳孔散大小鼠Ig型c帶序列一致，野生型B6和瞳孔散大小鼠CRD型c帶序列一致;2）與對(duì)應(yīng)野生型B6小鼠b條帶相比c條帶缺少外顯子E59和E24對(duì)應(yīng)序列共83個(gè)堿基，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 將以上RT-PCR產(chǎn)物直接測(cè)序出現(xiàn)重疊信號(hào)的條帶進(jìn)行T-A克隆后進(jìn)一步測(cè)序分析，結(jié)果顯示:所有所測(cè)序的野生型B6克隆的mRNA模板在剪接過(guò)程中，剪接體在外顯子E59后發(fā)生剪接;而由于G到A堿基突變，削弱剪接體對(duì)該剪接位點(diǎn)的剪接能

11、力，從而絕大多數(shù)測(cè)序的嚴(yán)重瞳孔散大小鼠克隆的mRNA模板在剪接過(guò)程中，剪接體未對(duì)緊接外顯子E59后的剪接位點(diǎn)進(jìn)行剪接，部分克隆序列顯示剪接體對(duì)其他潛在的剪接位點(diǎn)進(jìn)行了剪接。所以在測(cè)序的克隆中存在部分克隆不包含外顯子E59、部分克隆存在正常情況下尚未檢測(cè)到得“異?！奔艚铀a(chǎn)生的外顯子、剪接體跳過(guò)緊接外顯子E59后剪接位點(diǎn)而對(duì)其后潛在的剪接位點(diǎn)進(jìn)行剪接等結(jié)果。蛋白預(yù)測(cè)表明突變引起部分EGFβ-typeNrg1蛋白的減少，并被部分EGFa-t

12、ypeNrg1蛋白代替。
　　 4、Nrg1基因突變對(duì)瞳孔括約肌毒蕈堿受體表達(dá)的影響
　　 單獨(dú)使用毛果蕓香堿眼藥水滴眼后，瞳孔散大純合子及瞳孔部分散大雜合子小鼠瞳孔大小無(wú)明顯變化。單獨(dú)使用新斯的明或與毛果蕓香堿聯(lián)合對(duì)瞳孔散大純合子滴眼后，瞳孔散大純合子小鼠瞳孔大小無(wú)明顯變化。毛果蕓香堿、新斯的明腹腔注射后，瞳孔散大純合子小鼠瞳孔大小無(wú)明顯變化，但注射后小鼠出現(xiàn)較嚴(yán)重的流涎及輕度流淚反應(yīng)。阿托品腹腔注射瞳孔部分散大雜合子

13、小鼠后，小鼠瞳孔出現(xiàn)完全散大表型。以上結(jié)果顯示，瞳孔散大小鼠括約肌上M受體可能減少，且雜合子小鼠M受體比純合子數(shù)量多，其M受體經(jīng)過(guò)阿托品的封閉后，使得肌肉不能收縮。肌肉收縮程度在一定范圍內(nèi)與神經(jīng)遞質(zhì)（配體）與受體數(shù)量有關(guān)。過(guò)量的神經(jīng)遞質(zhì)，但有限的受體同樣不能使瞳孔散大雜合子小鼠括約肌完全收縮。
　　 膽堿型受體可分為煙堿型受體（Nicotinic Acetylcholine receptor，N受體）和毒蕈堿型受體（Muscar

14、inic Acetylcholine receptor，M受體）兩大類。M受體分為M1-M5五個(gè)亞型，括約肌上受體屬于M受體且其中以M3受體為主，M3基因敲除小鼠表現(xiàn)為部分瞳孔散大表型。文獻(xiàn)報(bào)道Nrg1對(duì)神經(jīng)-骨骼肌接頭處骨骼肌表面N受體具有聚集作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證瞳孔散大小鼠瞳孔括約肌上M受體減少的可能，使用免疫組化技術(shù)對(duì)括約肌上M3受體進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與野生型小鼠相比Dp1/Dp1小鼠瞳孔括約肌上M3受體分布明顯減少。
　　

15、 5、瞳孔散大小鼠模型的遺傳特性
　　 在使用酶切進(jìn)行基因分型基礎(chǔ)上，將Nrg1突變雜合子(Dp1/+)互交，Nrg1突變純合子（Dp1/Dp1）與突變雜合子(Dp1/+)配種，將Nrg1突變純合子（Dp1/Dp1）與野生型小鼠(+/+)配種，將Nrg1突變純合子（Dp1/Dp1）互交，分別記錄后代正常與瞳孔散大表型小鼠的數(shù)目（包括散大嚴(yán)重程度）及對(duì)應(yīng)的基因型。結(jié)果表明所有突變純合子小鼠表現(xiàn)為瞳孔散大表型，而雜合子小鼠瞳孔散大表