NB-UVB-308nm準(zhǔn)分子激光對皮膚毛囊神經(jīng)嵴干細(xì)胞向黑素細(xì)胞系定向分化的實(shí)驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 黑素細(xì)胞是一類特定的黑素生成細(xì)胞，其起源于外胚層的神經(jīng)嵴，成熟的黑素細(xì)胞在脊椎生物體的皮膚、毛發(fā)、眼睛等的色素呈現(xiàn)中起著決定性作用。黑素細(xì)胞所生成的黑素過多、過少或缺乏可引起諸如白癜風(fēng)、黃褐斑等多種色素障礙性皮膚病。所以，對于色素性疾病的基礎(chǔ)和臨床研究來說，有關(guān)黑素細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控過程的研究是個提綱挈領(lǐng)的切入點(diǎn)。近年來隨著各類干細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的不斷成熟，進(jìn)一步從干細(xì)胞的角度出發(fā)，探索黑素細(xì)胞前體階段向成熟黑素

2、細(xì)胞發(fā)育分化的過程和機(jī)制，對于探討諸如白癜風(fēng)之類的色素性疾病的發(fā)病機(jī)理，以及尋找新的治療靶點(diǎn)，或許都將是個有益的嘗試。
　　 近年來已有眾多研究證實(shí)毛囊部外毛根部隆突區(qū)域存在神經(jīng)嵴來源的多能成體干細(xì)胞，我們簡稱為毛囊部神經(jīng)嵴干細(xì)胞(HF-NCSCs)。HF-NCSCs能進(jìn)行自我更新，同時處于未分化的原始階段，在一定條件下可分化成黑素細(xì)胞、感覺神經(jīng)元、間質(zhì)細(xì)胞等特定組織類型。因此，利用HF-NCSCs模型，有助于我們深入研究從神經(jīng)

3、嵴干細(xì)胞階段→黑素前體細(xì)胞階段(黑素干細(xì)胞-黑素母細(xì)胞)→黑素細(xì)胞階段的發(fā)育分化過程和調(diào)控機(jī)制，為理解色素性疾病的發(fā)生、發(fā)展和恢復(fù)提供新的理論依據(jù)和新的思路。
　　 具體聯(lián)系到臨床，我們知道光療(如NB-UVB)治療白癜風(fēng)皮損后，患者色素的恢復(fù)呈現(xiàn)典型的以毛囊為中心向四周擴(kuò)展(點(diǎn)狀型)的方式。這種復(fù)色過程的本質(zhì)可能與HF-NCSCs向成熟MC細(xì)胞的分化發(fā)育密切相關(guān)。此外，我們注意到近年來涌現(xiàn)出的308nm準(zhǔn)分子激光在臨床應(yīng)用中較

4、NB-UVB治療白癜風(fēng)的療效更為確切快捷。但是，盡管NB-UVB/308nm準(zhǔn)分子激光臨床療效確切，相關(guān)的臨床回顧性研究也較多，但有關(guān)NB-UVB以及308nm準(zhǔn)分子激光治療白癜風(fēng)的機(jī)制方面的研究卻少有報道，相關(guān)的治療機(jī)理尚待進(jìn)一步明確。
　　研究目的：
　　 本課題設(shè)想以HF-NCSCs為細(xì)胞模型，結(jié)合臨床，擬開展有關(guān)NB-UVB以及308nm準(zhǔn)分子激光對體外培養(yǎng)的HF-NCSCs向MC系定向分化的影響及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗

5、研究。
　　研究方法：
　　 HF-NCSCs取材于C57BL/6小鼠觸須的外毛根鞘隆突區(qū)域，酶消化法得到單細(xì)胞懸液，置于神經(jīng)嵴干細(xì)胞增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以RT-PCR來鑒定它們的神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)；以免疫熒光來檢測在各種特定培養(yǎng)液誘導(dǎo)下各種定向分化的細(xì)胞所含的特異性抗體的表達(dá)，尤其是向MC定向分化的特異標(biāo)志物的表達(dá)。
　　 接下來，我們以0.1～0.6J劑量范圍內(nèi)的NB-UVB或308nm準(zhǔn)分子激光照射HF

6、-NCSCs，并換用MC特定培養(yǎng)基培養(yǎng)一定時間后，依次評估對定向分化的黑素細(xì)胞系的細(xì)胞活性、分化能力和遷移能力的影響。我們用細(xì)胞計數(shù)的方法比較對HF-NCSCs分化的黑素細(xì)胞系的細(xì)胞活性的影響。用免疫熒光、多巴染色、絡(luò)氨酸酶活性反應(yīng)、Realtime-PCR和Western blot等多種方法檢測NB-UVB對HF-NCSCs分化的MC系的細(xì)胞成熟度的影響。用Transwell小室檢測NB-UVB對HF-NCSCs向MC系分化過程中的細(xì)

7、胞遷移能力的影響。
　　 在進(jìn)一步的有關(guān)NB-UVB對HF-NCSCs向MC系分化過程中調(diào)控機(jī)制的探討方面，我們用Realtime-PCR檢測NB-UVB對黑素細(xì)胞調(diào)控因子Mc1R、Kit、Fzd4、NT3R、Ednra、EP1、TGFβR、Notch1、Sox10、Mitf Lef1和Pax3等的表達(dá)變化；用Western blot檢測Sox10、Mitf的蛋白表達(dá)變化；用Elisa檢測了受NB-UVB照射后細(xì)胞上清液中SCF

8、、α-MSH的含量。此外，我們進(jìn)一步用cAMP-PKA信號通路的激動劑IBMX添加入培養(yǎng)液，觀察其在NB-UVB對HF-NCSCs向MC系分化過程中的影響。
　　 在308nm準(zhǔn)分子激光和NB-UVB對HF-NCSCs向黑素細(xì)胞系定向分化過程的比較研究部分，我們同樣用細(xì)胞計數(shù)的方法觀察兩組對HF-NCSCs分化的黑素細(xì)胞系的細(xì)胞活性的影響；用Realtime-PCR檢測兩組受照射后分化而來的黑素細(xì)胞Tyro、Tyrp1、Tyrp

9、2等的表達(dá)差異；用Elisa和Realtime-PCR檢測兩組受照射后分化而來的MC系細(xì)胞上清液中SCF、α-MSH的含量，以及Mc1R、Kit、Sox10等的表達(dá)變化
　　研究結(jié)果：
　　 一、HF-NCSCs的培養(yǎng)鑒定及向黑素細(xì)胞系的定向分化
　　 從小鼠觸須的毛囊隆突部位分離培養(yǎng)得到的HF-NCSCs以懸浮狀態(tài)或貼壁狀態(tài)呈克隆性生長。懸浮狀態(tài)克隆性生長時，細(xì)胞形態(tài)顯示為特征性的三維球體樣結(jié)構(gòu)。RT-PCR顯

10、示，它們表達(dá)多種NCSC特異性標(biāo)志物如Nestin、p75、Sox10、Snail-1、Twist-1等，一些皮膚組織來源的干細(xì)胞標(biāo)志物如Myo10、Msx2，以及一些通用干細(xì)胞的標(biāo)志物如K1f4和Wnt1等。在特定培養(yǎng)液誘導(dǎo)下，HF-NCSCs均可以定向分化成黑素細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元等多種細(xì)胞類型。
　　 在本課題主要關(guān)注的HF-NCSCs往黑素細(xì)胞系定向分化這條主線上，我們以HF-NCSC為種子細(xì)胞，經(jīng)過1～2周的特定黑

11、素細(xì)胞培養(yǎng)液的誘導(dǎo)培養(yǎng)，所得到的分化細(xì)胞呈現(xiàn)類似正常MC的雙極樹突或多極樹突外觀。更重要的是，部分分化細(xì)胞呈多巴反應(yīng)陽性，并表達(dá)MC特異標(biāo)志物Mitf、Tyro，表明所得到的分化細(xì)胞符合黑素細(xì)胞或黑素母細(xì)胞的相關(guān)特征。
　　 二、NB-UVB對HF-NCSCs向黑素細(xì)胞系定向分化的干預(yù)研究
　　 在0.1～0.6J劑量范圍內(nèi)，隨著照射劑量增大，NB-UVB對HF-NCSCs分化的MC系細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)抑制作用。在HF-NC

12、SCs向MC系定向分化過程中細(xì)胞的成熟度方面，NB-UVB作用能逐漸增加由HF-NCSCs分化的MC系細(xì)胞的Tyro、Tyrp1、Tyrp2等的表達(dá)。在HF-NCSCs向MC系定向分化過程中細(xì)胞遷移的影響方面，遷移試驗表明由HF-NCSCs分化來的MC系細(xì)胞在小劑量NB-UVB作用下遷移能力無明顯影響，劑量增大則遷移能力逐漸下降。而對于HF-NCSCs來說，NB-UVB則在一定劑量范圍內(nèi)能促進(jìn)HF-NCSCs的遷移。
　　 三、

13、NB-UVB對HF-NCSCs向黑素細(xì)胞系定向分化的機(jī)制研究
　　 進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，在NB-UVB作用影響下，由HF-NCSCs分化而來的MC系細(xì)胞的Mc1R、Kit、Fzd-4、EP-1、Sox10、Mitf等的表達(dá)，以及細(xì)胞上清液中SCF、α-MSH的含量均有不同程度的增加，其中以Mc1R、Kit、Sox10差異最為顯著。此外，cAMP-PKA信號通路的激動劑IBMX添加入培養(yǎng)液后能促進(jìn)NB-UVB照射后由HF-NCS

14、Cs分化而來的MC系細(xì)胞的成熟。
　　 四、308nm準(zhǔn)分子激光和NB-UVB對HF-NCSCs向黑素細(xì)胞系定向分化的比較研究
　　 在相同劑量、相同時間范圍內(nèi)，308nm準(zhǔn)分子激光較NB-UVB能更明顯增加由HF-NCSCs分化而來的MC系細(xì)胞的Tyro、Tyrp1、Tyrp2等的表達(dá)。此外，308nm準(zhǔn)分子激光作用組的細(xì)胞上清液中α-MSH的含量較NB-UVB組明顯增高。
　　研究結(jié)論：
　　 一、H

15、F-NCSCs來源豐富不受限，位置表淺易取材，多向分化運(yùn)用廣，倫理道德爭議小，是比ES更理想的干細(xì)胞來源，是研究MC前體階段發(fā)育分化及相關(guān)調(diào)控機(jī)制的理想細(xì)胞模型。
　　 二、NB-UVB在一定劑量范圍內(nèi)盡管隨著劑量增加，由HF-NCSCs分化的MC系細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)抑制趨勢，但另一方面所得到的MC系細(xì)胞的功能在增強(qiáng)，表明了NB-UVB能直接有效地促進(jìn)HF-NCSCs向成熟的MC細(xì)胞分化發(fā)育。在細(xì)胞遷移方面的影響上，NB-UVB在一

16、定合適的劑量范圍內(nèi)可提高HF-NCSCs的遷移能力；而對于由HF-NCSCs分化來的MC系細(xì)胞，NB-UVB在小劑量作用下對其的遷移能力無明顯影響，劑量增大由HF-NCSCs分化來的MC系細(xì)胞移能力則呈現(xiàn)逐漸下降。
　　 三、Mc1R、Kit、Sox10以及cAMP-PKA信號通路等在NB-UVB促HF-NCSCs向成熟的MC分化發(fā)育中可能起主要的調(diào)控影響作用。
　　 四、在相同時間、相同劑量的作用下，308nm準(zhǔn)分子激