化痰祛濕活血方對(duì)非酒精性脂肪變肝細(xì)胞模型AMPK-ACC-CPT-1信號(hào)通路的影響.pdf

1、　　目的： 成功建立非酒精性脂肪變體外肝細(xì)胞模型,從細(xì)胞學(xué)層次及分子生物學(xué)水平探討化痰祛濕活血方對(duì) AMPK/ACC/CPT-1 信號(hào)通路的調(diào)控作用以及對(duì)甘油三酯的干預(yù)作用,從而初步揭示化痰祛濕活血方對(duì) NAFLD 體外肝細(xì)胞模型損傷的保護(hù)作用及其可能作用機(jī)制,為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。
　　材料與方法： 制作化痰祛濕活血方高中低三個(gè)劑量的藥物溶液,分別相當(dāng)于成人正常用量的 20 倍、10 倍和 5 倍,多烯磷脂酰膽堿藥物溶液

2、相當(dāng)于成人正常用量的10倍,然后以Wistar大鼠灌胃,抽取腹主動(dòng)脈血制作藥物血清,90%RPMI 1640 培養(yǎng)液+10%胎牛血清培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞 L02 細(xì)胞株,每 2~3 天傳代一次,將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞分為正常組、模型組、化痰活血祛濕方高劑量組、中劑量、低劑量組以及多烯磷脂酰膽堿(易善復(fù))藥物組六組；接種于六孔培養(yǎng)板中。除正常組外,其它各組以40ug/ml濃度的油酸作用于 L02細(xì)胞24小時(shí),復(fù)制非酒精性脂肪變體外肝細(xì)胞模型,制

3、作細(xì)胞爬片,以油紅O染色確定造模成功后,正常組和模型組更換為正常胎牛血清培養(yǎng)液,治療組則對(duì)應(yīng)地以含10%藥物血清的培養(yǎng)液即(10%藥物血清+90%RMPI1640培養(yǎng)液)干預(yù)24小時(shí),干預(yù)結(jié)束后分別觀察各組細(xì)胞油紅O染色、檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量以及AMPK、ACC、CPT-1和AdipoR2 mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.油紅 O 染色：正常組細(xì)胞形態(tài)正常,輪廓清晰,細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)紅色脂滴,細(xì)胞核著色較深

4、,清晰可見(jiàn)；模型組細(xì)胞明顯腫大,輪廓模糊,細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)較多橘紅色脂滴,并出現(xiàn)脂滴融合現(xiàn)象,細(xì)胞核染色較淡；化痰活血祛濕方高劑量組細(xì)胞邊緣較模型組清晰,形態(tài)尚可,細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)橘紅色脂滴,但明顯少于模型組,細(xì)胞核著色亦明顯較模型組細(xì)胞核深；中劑量組細(xì)胞邊緣模糊,細(xì)胞內(nèi)仍可見(jiàn)少量橘紅色脂滴,較模型組量少,但與高劑量組差別不大；低劑量組細(xì)胞邊緣模糊,細(xì)胞內(nèi)仍可見(jiàn)橘紅色脂滴；易善復(fù)組較模型組輪廓清晰,細(xì)胞內(nèi)脂滴亦較模型組有所減少。
　　2.

5、甘油三酯含量：與正常組相比,模型組甘油三酯的含量明顯升高,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；化痰活血祛濕方高劑量組較模型組相比,TG含量明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；化痰祛濕活血方中劑量組、低劑量組及易善復(fù)對(duì)照組較模型組相比,TG含量均有所降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而中劑量組、低劑量組與易善復(fù)組之間 TG 含量變化差異不甚明顯,統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差異(P>0.05)；化痰活血祛濕方中、低劑量組之間的TG含量亦無(wú)明顯

6、差異,結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3.AMPK mRNA的表達(dá)情況： 模型組AMPK mRNA較正常組表達(dá)下降,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；化痰祛濕活血方高劑量組、中劑量組、低劑量組及易善復(fù)組表達(dá)均較模型組增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組與低劑量組較正常組細(xì)胞表達(dá)增加具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.01),而化痰活血祛濕方高、中、低劑量組和易善復(fù)對(duì)照組之間經(jīng)分析,結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

7、　4.ACC mRNA的表達(dá)情況：與正常組相比,其他各組 ACC基因表達(dá)均有所降低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。較模型組,化痰祛濕活血方高劑量組、低劑量組和易善復(fù)組表達(dá)均有所降低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.CPT-1mRNA的表達(dá)情況：與正常組相比,化痰活血祛濕方各劑量組以及易善復(fù)組CPT-1表達(dá)均升高,較正常組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05),而模型組較正常組升高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中藥復(fù)方中、低劑量組

8、較模型組 CPT-1表達(dá)升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而與易善復(fù)組比較則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.AdipoR2 mRNA的表達(dá)情況：與正常相比,中藥各劑量組AdipoR2 mRNA表達(dá)有所降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而易善復(fù)組 AdipoR2 mRNA表達(dá)明顯增加,較模型組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),同時(shí),易善復(fù)組 AdipoR2的 mRNA表達(dá)增加較中藥各劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.40ug/ml