新型鬼臼毒素衍生物L(fēng)GN抗人肺腺癌細(xì)胞A549作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　 本文研究新型鬼臼毒素衍生物L(fēng)GN抑制人肺腺癌細(xì)胞株A549作用，并初步探討其作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、利用體外抗腫瘤篩選的方法MTT法和SRB法檢測(cè)LGN的體外抗腫瘤活性。MTT法測(cè)定LGN和陽(yáng)性對(duì)照藥依托泊苷(VP-16)體外對(duì)各腫瘤細(xì)胞（A549、SKVO3、LOVO、Hela、HepG-2、K562）及正常細(xì)胞(VEC、MC-3T3)的IC50值或GI50值。
　　 2、利用

2、Giemsa染色法在光學(xué)顯微鏡下觀察LGN作用后A549細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化和利用Hoechst染色法在熒光顯微鏡下觀察LGN作用后A549細(xì)胞株細(xì)胞核形態(tài)的變化。
　　 3、利用DNAladder法分析LGN作用A549細(xì)胞后，細(xì)胞染色體是否出現(xiàn)規(guī)律的斷裂情況（細(xì)胞凋亡特征）。
　　 4、利用流式細(xì)胞術(shù)定量分析不同濃度LGN對(duì)A549細(xì)胞周期及其凋亡率的影響。
　　 5、利用RT-PCR檢測(cè)LGN在不同濃度（

3、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L）對(duì)A549細(xì)胞p53、bcl-2、bax、p21、topoⅡα、PCNA、caspase-3mRNA表達(dá)的影響。
　　 6、利用Western-blot檢測(cè)LGN在不同濃度（0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L）對(duì)A549細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、LGN體外抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖
　　 利用常用的簡(jiǎn)便體外抗腫瘤

4、篩選法:MTT和SRB法檢測(cè)了LGN的體外抑制腫瘤增殖的作用，結(jié)果表明LGN對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有較好的抑制作用，IC50值為0.22～0.77μmol/L;對(duì)A549抑制作用尤其顯著IC50值為0.22±0.11μmol/L，比陽(yáng)性對(duì)照藥依托泊苷（VP-16IC50值為4.99±0.45μmol/L）在體外顯示了更強(qiáng)的抑制腫瘤增殖的效果大約高22倍。實(shí)驗(yàn)顯示LGN對(duì)人的正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)和成骨細(xì)胞(MC-3T3)具有較低的毒性IC

5、50值分別為28.41±1.49，21.63±1.11μmol/L，提示其對(duì)腫瘤細(xì)胞有較好的選擇性。進(jìn)一步通過(guò)SRB法測(cè)得LGN對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的GI50為0.43～1.72μmol/L，與MTT結(jié)果一致。接著又通過(guò)生長(zhǎng)曲線法觀察不同濃度LGN對(duì)A549細(xì)胞作用7天后對(duì)其生長(zhǎng)狀態(tài)產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示3μmol/LLGN在第二天就可以完全抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴(lài)性，同等濃度LGN對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照的VP-16。

6、>　　 2、LGN誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡
　　 2.1、形態(tài)學(xué)觀察:Giemsa染色和Hoechst33342熒光染色結(jié)果均顯示LGN作用于A549細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)染色體固縮、凝集，凋亡小體的產(chǎn)生，核膜的皺縮等凋亡的特征性改變。
　　 2.2、生化學(xué)觀察:DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示LGN作用于A549細(xì)胞后出現(xiàn)典型“DNALadder”梯子圖。
　　 2.3、流式細(xì)胞儀檢測(cè):流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示A549凋亡細(xì)胞的比例與L

7、GN濃度間具有良好的量效關(guān)系。
　　 以上結(jié)果均可以說(shuō)明LGN能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 3、LGN對(duì)A549細(xì)胞周期的影響
　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布顯示LGN對(duì)A549各生長(zhǎng)時(shí)相都有抑制效應(yīng)，G1期細(xì)胞的比例下降，S期細(xì)胞的比例先略升高后降低，G2+M期細(xì)胞的比例增加明顯，且呈明顯的劑量依賴(lài)性，表明LGN可以將細(xì)胞阻滯在G2+M期。
　　 4、LGN對(duì)A549凋亡相關(guān)基因mRNA和to

8、poⅡα基因mRNA的測(cè)定
　　 RT-PCR結(jié)果顯示不同濃度的LGN（0.5、4、8μmol/L）作用于A549細(xì)胞24h后，成劑量依賴(lài)性地上調(diào)了p21、bax、p53、caspase-3、topoⅡα的mRNA表達(dá)，同時(shí)降低bcl-2和PCNAmRNA的表達(dá)，同溶劑對(duì)照組相比有顯著性的差異（P＜0.05）。
　　 5、LGN對(duì)A549PCNA蛋白表達(dá)的測(cè)定
　　 Western-blot結(jié)果顯示不同濃度的LG