鬼臼毒素衍生物ZM-16抗腫瘤多藥耐藥作用及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究新鬼臼毒素衍生物ZM-16體外抗人源腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用及其誘導(dǎo)耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，初步探討ZM-16抗腫瘤多藥耐藥作用機(jī)制，為抗腫瘤新藥開(kāi)發(fā)、研制提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：1 MTT法和SRB法檢分別測(cè)ZM-16對(duì)Hela、Skov3、Lovo、KB、KBv200、K562和K562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性。2以K562/A02和KBv200為研究對(duì)象，采用Giemsa染色技術(shù)、Hoechst33342/PI

2、熒光雙染技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)觀察了ZM-16誘導(dǎo)K562/A02和KBv200細(xì)胞凋亡與作用效果。3 RT-PCR法檢測(cè)不同濃度ZM-16（1μM、4μM）對(duì)K562/A02細(xì)胞p53、p21、caspase-3、bcl-2、bax等凋亡相關(guān)基因以及mdr-1、topoⅡα、topoⅡβ耐藥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)的影響。4 Western-blot法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)不同濃度ZM-16（1μM、4μM）對(duì)K562/A

3、02細(xì)胞P-gp表達(dá)的影響，初步分析了ZM-16抗腫瘤多藥耐藥的機(jī)制。5激光共聚焦檢測(cè)不同濃度ZM-16（1μM、4μM）對(duì)KBv200細(xì)胞微管的影響。
　　 結(jié)果：1 MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZM-16對(duì)多種貼壁腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用，IC50為0.43～20.95μM。從SRB結(jié)果可看出：ZM-16對(duì)人紅白血病細(xì)胞（K562）及阿霉素誘導(dǎo)的多藥耐藥株（K562/A02）均有抑制作用，G150分別為：4.39μM和2.28μM。通過(guò)

4、對(duì)K562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的觀察，發(fā)現(xiàn)不同濃度的ZM-16對(duì)K562/A02細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并且具有顯著的量效關(guān)系。
　　 2 ZM-16能夠誘導(dǎo)K562/A02和KBv200細(xì)胞凋亡。不同濃度的ZM-16（1μM、4μM）作用于K562/A02細(xì)胞24h后，分別用Giemsa染液和熒光染料Hoechst33342/PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，前者將細(xì)胞核染成粉紅色，胞漿染成藍(lán)紫色。未加藥組的細(xì)胞核染色均一、結(jié)構(gòu)完整、核

5、漿比值大；給藥組細(xì)胞呈現(xiàn)核膜皺縮，核邊集、碎裂。經(jīng)熒光雙染后的細(xì)胞在紫外光激發(fā)下發(fā)藍(lán)色和紅色熒光，ZM-16可使細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生聚集、碎裂，細(xì)胞膜不斷出芽、脫落，細(xì)胞變成數(shù)個(gè)大小不等的凋亡小體，并且隨著ZM-16濃度的加大，鏡下具有這種細(xì)胞形態(tài)變化的細(xì)胞數(shù)量愈加明顯，凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加。在DNA凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中，用不同濃度的ZM-16分別作用于KBv200細(xì)胞24h，提取DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可呈現(xiàn)典型的“DNA梯子樣”圖譜。應(yīng)用

6、流式細(xì)胞儀進(jìn)行腫瘤細(xì)胞凋亡率測(cè)定，可見(jiàn)經(jīng)不同濃度的ZM-16（1μM、4μM）作用于K562/A02細(xì)胞24h后，出現(xiàn)一個(gè)明顯“亞二倍體峰”，即凋亡峰，且凋亡細(xì)胞的比例隨著ZM-16濃度的升高而增加，呈一定的劑量依賴性。
　　 3 用不同濃度的ZM-16分別作用于K562/A02細(xì)胞6h和24h，短時(shí)間低劑量可使細(xì)胞周期阻斷在S期，延長(zhǎng)作用時(shí)間及增加給藥濃度細(xì)胞被阻滯于G2/M期。
　　 4 RT-PCR結(jié)果顯示1μM、

7、4μM ZM-16能升高p53、p21、caspase-3 mRNA的水平，同時(shí)降低bcl-2、mdr-1 mRNA的水平，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)bax、topoⅡα、topoⅡβ作用不明顯。
　　 5 經(jīng)不同濃度的ZM-16（1μM、4μM）作用于K562/A02細(xì)胞48h，Western-blot及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示ZM-16可下調(diào)P-gp表達(dá)，且呈一定的劑量依賴性，Western-blot結(jié)果中高劑量組與陰性

8、對(duì)照組相比P<0.01。
　　 6 不同濃度的ZM-16（1μM、4μM）作用于KBv200細(xì)胞6h后，通過(guò)微管免疫熒光法觀察ZM-16對(duì)微管以及細(xì)胞核形態(tài)的影響，可見(jiàn)對(duì)照組的KBv200細(xì)胞，微管形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完好；而用1μM ZM-16處理后微管結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，數(shù)量減少，呈斷片狀，細(xì)胞核完整性受到一定影響；高劑量4μM的ZM-16則使絕大部分微管結(jié)構(gòu)破壞，微管不再成束，僅在核周殘留少量彌散點(diǎn)狀

9、不規(guī)則熒光，細(xì)胞核內(nèi)部結(jié)構(gòu)無(wú)法呈現(xiàn)。陽(yáng)性對(duì)照藥鬼臼毒素（1μM）處理后的細(xì)胞微管不再成束，呈現(xiàn)更明顯的點(diǎn)狀不規(guī)則熒光。高劑量ZM-16處理后的細(xì)胞微管形態(tài)變化與鬼臼毒素處理后結(jié)果相似。
　　 結(jié)論：ZM-16結(jié)構(gòu)新穎、體外抑瘤效果明顯，而且對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞也有明顯抑制作用；能將腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻斷在G2/M期，同時(shí)通過(guò)影響p53、p21、caspase.3、bcl-2、mdr-1 mRNA及P-gp蛋白水平，抑制細(xì)胞微管聚合，