四硫鉬酸鹽誘導的適度銅缺乏對大鼠血管球囊損傷反應的影響.pdf

1、研究背景與目的:從球囊擴張到藥物支架，冠心病的治療經(jīng)歷了里程碑式的發(fā)展，但再狹窄的防治仍然是困擾臨床醫(yī)生的一個課題。藥物洗脫支架在這方面顯示出良好的效果，但要預言其在治療各種斑塊類型中的療效似乎還為時尚早。隨著這類支架的使用增多，相關的并發(fā)癥報道也增多起來，如亞急性和晚期血栓形成以及由于血管毒性作用所致的動脈瘤形成等。多支血管病變時，藥物支架的費用也難以承受。因此，尋找一種安全有效、使用簡便、并能長久解決再狹窄的方法仍是有必要的?？诜?/p>

2、物或許是一種可選擇的治療策略。 近年來對再狹窄機制的研究表明，炎癥反應在新內(nèi)膜形成過程中起著重要作用。激活的血小板和浸潤的白細胞在血管損傷部位釋放出大量細胞因子、黏附分子、趨化因子和多種蛋白酶等，啟動了一系列的反應導致血管SMC增殖和遷移，血管新內(nèi)膜形成和管腔狹窄。核因子κB(NF-κB)的活化是參與炎癥反應和細胞增殖基因表達的關鍵步驟。因此部分學者認為，抑制NF-κB的激活可以作為防治介入術(shù)后血管炎癥反應和再狹窄的一種策略。

3、 四硫鉬酸鹽(tetrathiomolybdate，MOS42-，TM)是一種銅鰲合劑，通過口服可有效的與腸道和血漿中的銅及蛋白結(jié)合形成復合物，使之被清除，從而降低血銅含量。銅是人體一種必需的營養(yǎng)元素，它存在于人體的所有細胞和組織中，參與多種重要的代謝活動，是多種蛋白酶、細胞因子、生長因子和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)揮功能的必需成分。銅是血管形成與分化的有力誘導劑，且可以促進動脈損傷反應引起的再狹窄。TM銅鰲合作用使血銅降低具有抗炎、抗

4、纖維化和抗血管形成作用，在腫瘤的臨床治療實驗中取得了良好的效果，TM可以通過抑制腫瘤細胞NF-κB的激活抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。并且TM通過口服作用于全身，安全有效，副作用少，主要是使用過量導致的貧血和/或白細胞減少，減少用藥量或停藥后即可恢復。人體能夠長期耐受由TM誘導的Cp降低至基礎水平20％的顯著銅缺乏。 TM在心血管疾病方面的應用研究僅有少數(shù)報道，本課題研究TM誘導的銅缺乏對大鼠頸動脈球囊損傷后NF-κB活性的影響，及iN

5、OS、COX-2、基質(zhì)金屬蛋白酶和黏附因子等由NF-κB調(diào)控基因表達的因子的影響，探討TM誘導的銅缺乏對血管損傷后再狹窄的影響及可能的部分機制，國內(nèi)外尚無類似研究。 方法:本研究通過SD大鼠頸動脈球囊剝脫術(shù)建立血管損傷和再狹窄模型。大鼠隨機分組，TM20組給予TM強飼，使血清銅藍蛋白(Cp)水平在術(shù)前下降到正常值的(20±5)％，并維持到術(shù)后取材時；TM50組使Cp水平于術(shù)前下降到正常值的(50±5)％，并維持到術(shù)后取材；對照組

6、給予蒸餾水強飼，術(shù)后于不同時點取材。采用HE染色光鏡觀察血管內(nèi)膜增生情況；電泳流動漂移技術(shù)(eletrophoreticmobilityshiftassayEMSA)法測定NF-κB活性激活情況；免疫印記法(WesternBlot)檢測血管組織iNOS、COX-2的蛋白表達；采用明膠酶譜法檢測MMP-2和MMP-9的活性，免疫印記法檢測MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的蛋白表達；免疫印記法檢測VCAM-1蛋白表達。觀察

7、TM對上訴各指標的影響，探討TM誘導的銅缺乏對血管損傷后再狹窄的影響及可能的機制。 結(jié)果: (一)TM治療對血管損傷后內(nèi)膜增生的影響HE染色可見對照組大鼠頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后14d及28d內(nèi)血管內(nèi)膜顯著增厚，血管強狹窄；TM鰲合治療使大鼠血銅降低到正常水平的20％時，可顯著抑制新生內(nèi)膜的形成，血管腔無明顯再狹窄。 (二)TM對NF-κB活性的影響對照組大鼠頸動脈球囊損傷后6h，NF-κB活性即顯著升高達2.7倍；術(shù)

8、后1dNF-κB活性略下降；術(shù)后3d～5d，NF-κB活性逐漸恢復到接近術(shù)前水平。TM20組頸動脈球囊損傷后6h，NF-κB活性也略有升高，為基礎值的1.4倍，但較對照組活性顯著降低，術(shù)后1d其活性就下降到接近正常，較對照組恢復更快。 (三)TM對iNOS和COX-2表達的影響對照組血管損傷后14d可檢測到iNOS和COX-2的顯著表達，TM誘導大鼠血清Cp下降到基礎水平的50％時，即可抑制iNOS和COX-2的蛋白表達；Cp降

9、低到基礎值的20％時，iNOS和COX-2的蛋白表達被顯著抑制。 (四)TM對MMP-2/-9和TIMP-1/-2表達的影響1.未損傷的大鼠頸動脈組織MMP-2僅有少量活性形式，MMP-9無活性表達。對照組血管損傷后1d，MMP-9活性迅速提高，并持續(xù)到損傷后7d；MMP-2的活性在損傷后7～14d達到高峰，并在損傷后28d時仍維持在較高水平。TM20組MMP-9和MMP-2的活性均被顯著抑制，活性峰值明顯減低，且損傷后28d時

10、MMP-2活性已基本恢復到正常。 2.對照組MMP-2/-9的蛋白表達與其活性變化一致，TM20組MMP-2/-9的蛋白表達水平顯著降低。 3.術(shù)后14d，TM50組MMP-2蛋白表達水平也較對照組降低，但高于TM20組蛋白表達水平。 4.TIMP-1/-2的蛋白水平在大鼠頸動脈球囊損傷后1～3d較術(shù)前有所下降，隨后很快恢復到術(shù)前水平。TM20組TIMP-1/-2的蛋白表達水平與對照組無明顯差別。 (五)

11、TM對VCAM-1蛋白表達水平的影響VCAM-1在球囊損傷后14d的大鼠頸動脈組織有顯著表達，TM20組VCAM-1表達水平較對照組明顯降低。 結(jié)論: 1.TM鰲合血清銅，使銅水平降低到基礎值的20％時能夠顯著抑制大鼠頸動脈球囊損傷后的內(nèi)膜增生反應，減輕血管腔狹窄。 2.TM誘導的銅缺乏能夠顯著抑制大鼠頸動脈球囊損傷后NF-κB的短暫激活，并使其更快恢復到基礎水平。這可能是TM治療抑制再狹窄的機制之一。

12、3.TM誘導的銅缺乏能夠抑制大鼠頸動脈球囊損傷后iNOS和COX-2的蛋白表達，這可能是通過抑制由NF-κB的激活實現(xiàn)的。并且這種抑制作用與TM使用劑量相關。 4.血管損傷可激活MMP-2/-9的活性與表達，MMP-9主要作用于血管損傷早期，MMP-2的作用持續(xù)于整個損傷修復期，尤其在晚期更獨立發(fā)揮作用。 5.TM誘導的大鼠銅缺乏能夠有效抑制MMP-2和-9的活性與表達，MMP-2和-9基因表達NF-κB調(diào)控，TM對MM

13、P-2/-9的抑制的部分機制可能是通過抑制NF-κB激活產(chǎn)生的。 6.TM誘導的銅缺乏的對MMP-2表達的抑制是劑量依賴性的。 7.銅缺乏對血管MMPs的抑制因子TIMP-1和TIMP-2的表達無明顯影響。 8.TM誘導的銅缺乏通過抑制MMP-2和-9的活性和表達，而不影響TIMP-1和-2的表達，從而抑制血管損傷后SMC的遷移和增殖，以及ECM的積累可能是TM抑制新生內(nèi)膜形成的機制之一。 9.TM誘導的