麻黃—杏仁藥對(duì)配伍的主要化學(xué)成分及尿液代謝物的研究.pdf

1、藥對(duì)，也稱對(duì)藥，是指臨床常用的相對(duì)固定的兩味藥或三味藥的配伍組合。藥對(duì)是單味中藥與復(fù)方之間的橋梁，是復(fù)方的主干，也是中藥配伍的基礎(chǔ)。“藥對(duì)”之名在《神農(nóng)本草經(jīng)》中雖未直接提出，但已有“藥有陰陽配合、子母兄弟”等配伍理論的記載。藥對(duì)的配伍符合中醫(yī)“七情合和”理論和君臣佐使組合法度，具備了復(fù)方的基本主治功能，成為中醫(yī)遣方用藥的特色之一，具有緊扣病機(jī)、功效專一、療效確切等特點(diǎn)。藥對(duì)配伍的核心問題是達(dá)到增效減毒作用，其研究無論在理論上還是在實(shí)踐

2、上都具有重要意義。運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)從化學(xué)、藥理、炮制、臨床配伍應(yīng)用等方面對(duì)藥對(duì)配伍進(jìn)行深入研究，可以揭示某藥對(duì)的配伍作用，探索其機(jī)制，尋求發(fā)揮最佳作用的配合用藥劑量比例，找出其量效與時(shí)效以及毒效間的關(guān)系，更好的發(fā)揮藥物的治療效果。
　　 三拗湯出自《太平惠民和劑局方》，由麻黃、苦杏仁、生甘草三味藥組成，主治感冒風(fēng)邪、鼻塞聲重、頭痛目眩、咳嗽多痰等證。當(dāng)然，這與方中所含的物質(zhì)基礎(chǔ)密切相關(guān)。本藥對(duì)組成規(guī)律研究遵循中醫(yī)藥的“理法方藥”

3、診療理論，選擇三拗湯中的麻黃-杏仁藥對(duì)為研究對(duì)象，二者相須而用，以藥味配比為切入點(diǎn)，從化學(xué)成分的含量變化及哮喘大鼠尿液中內(nèi)源性小分子代謝物質(zhì)（包括有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸等）的動(dòng)態(tài)應(yīng)答變化來評(píng)價(jià)該藥對(duì)配伍的合理性，揭示藥對(duì)的藥味、藥量的變化可引起“藥對(duì)”變化的規(guī)律和內(nèi)涵。以此規(guī)律為指導(dǎo)，變經(jīng)驗(yàn)用藥為科學(xué)用藥，為中醫(yī)臨床遣方用藥及開發(fā)新藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：
　　 (1)通過比較麻黃與杏仁不同配伍配比對(duì)水煎液中

4、主要有效成分含量的影響，以探求麻黃-杏仁藥對(duì)的化學(xué)變化規(guī)律。
　　 (2)通過考察溫度和酸堿對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷異構(gòu)化的影響，為進(jìn)一步研究配伍對(duì)苦杏仁中有效成分的影響提供參考。
　　 (3)通過比較麻黃與杏仁配伍對(duì)卵蛋白致敏哮喘癥候的代謝組學(xué)研究，探求麻黃-杏仁配伍前后的整體調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.資料收集
　　 以計(jì)算機(jī)檢索、手工追溯檢索等手段相結(jié)合，充分利用中國(guó)學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)、P

5、ubMed、SienceDirect等數(shù)據(jù)庫(kù)，廣泛查閱有關(guān)三拗湯、麻黃、杏仁及其有效成分的藥理作用、毒副作用、代謝和排泄的研究資料。
　　 2.麻黃-杏仁不同配伍配比的體外主要有效成分研究
　　 分析在制備過程（體外）中化學(xué)成分?jǐn)?shù)與量的變化，探討麻黃、杏仁主要效應(yīng)成分在制備過程中的化學(xué)變化和相互影響。本實(shí)驗(yàn)選取三拗湯中麻黃-杏仁(1∶1)為研究對(duì)象，依據(jù)藥對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的配比上下成倍浮動(dòng)，制備了麻黃、杏仁單味藥水煎液、麻黃-

6、杏仁1∶0.5、1∶1、1∶2三個(gè)配伍比例的水煎液、三拗湯水煎液，采用高效液相色譜法(HPLC)分別對(duì)不同比例的麻黃與杏仁配伍后各有效成分的含量變化進(jìn)行分析研究。
　　 3.苦杏仁中苦杏仁苷的存在形式及其影響因素研究
　　 以苦杏仁（不去皮尖）為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法測(cè)定苦杏仁在不同煎煮溫度下L-苦杏仁苷與D-苦杏仁苷的峰面積，同時(shí)用該法定性考察酸堿對(duì)苦杏仁苷單體異構(gòu)化的影響。
　　 4.麻黃-杏仁不同配伍

7、干預(yù)卵蛋白致敏哮喘癥候的代謝組學(xué)研究
　　 采用卵蛋白(OVA)霧化吸入致敏激發(fā)法復(fù)制哮喘大鼠。各組于致敏前1d開始收集早上9點(diǎn)-下午19點(diǎn)，共10h的尿液作為空白對(duì)照。除陽性藥組外，其余各組收集噴霧第1，3，5，7d相同時(shí)間段的尿液。將收集的尿液直接衍生化。采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定各組大鼠尿液代謝物譜。運(yùn)用軟件Simca-P12.0進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，研究麻黃-杏仁配伍干預(yù)卵蛋白致

8、敏哮喘癥候代謝物組學(xué)的影響規(guī)律。對(duì)噴霧第7d(即給藥第5d)的空白組、模型組、麻黃組、杏仁組和麻杏配伍組的尿液代謝輪廓進(jìn)行PLS-DA分析，對(duì)其特征抽提及模式識(shí)別。分析麻黃組、杏仁組、麻杏配伍組生物標(biāo)志物的差異及水平變化，結(jié)合現(xiàn)有的生物化學(xué)知識(shí)闡釋麻黃-杏仁配伍前后的整體調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 運(yùn)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，多組均數(shù)比較采用單向方差分析(On

9、e-wayANOVA)，方差齊性采用LSD法;方差不齊，Welch法校正后采用Games-Howell法多重比較。所有檢驗(yàn)水平α=0.05(雙側(cè))。
　　 結(jié)果：
　　 1麻黃-杏仁不同配伍配比的體外主要有效成分研究
　　 采用HPLC分別測(cè)定麻黃與杏仁不同比例配伍的水煎液中苦杏仁苷、去甲基麻黃堿(NME)、去甲基偽麻黃堿(NMP)、麻黃堿(E)、偽麻黃堿(PE)和甲基麻黃堿(ME)的煎出量。與麻黃單煎液相比，當(dāng)

10、杏仁的配伍比例增至麻黃2倍時(shí)，麻黃-杏仁合煎液中5種麻黃堿的含量發(fā)生顯著性變化(P＜0.05)。與杏仁單煎液相比，麻黃-杏仁配伍后，隨著麻黃的配伍比例增大，水煎液中苦杏仁苷的含量均有不同程度的增加。
　　 2溫度和酸堿對(duì)苦杏仁苷異構(gòu)化的影響
　　 苦杏仁中的苦杏仁苷在不同溫度段內(nèi)具有不同的異構(gòu)化表現(xiàn);苦杏仁苷單體在醋酸中未發(fā)生異構(gòu)化，而在氨水、氫氧化鈉的作用下均可發(fā)生異構(gòu)化。
　　 3麻黃-杏仁不同配伍干預(yù)卵蛋白

11、致敏哮喘癥候的代謝組學(xué)研究
　　 3.1卵蛋白致敏大鼠可成功建立過敏性支氣管哮喘模型
　　 3.2通過對(duì)模型組造模前后不同時(shí)間的大鼠尿液代謝物組進(jìn)行PCA分析，繪制出反映組間離散程度的Score Plot圖，結(jié)果顯示各組區(qū)分良好，不同時(shí)間模型組與空白組相比可被分類，說明給予卵蛋白噴霧后大鼠正常生理代謝被干擾;模型組隨著造模后所處時(shí)間的不同，其代謝產(chǎn)物發(fā)生了一定的變化，不同時(shí)間模型組偏離正常組的程度明顯不同，其中噴霧1d組

12、，內(nèi)源性產(chǎn)物的種類、濃度和相對(duì)比例發(fā)生擾動(dòng)，逐漸遠(yuǎn)離空白組，從PCA圖可清楚看到造模過程的動(dòng)態(tài)變化，模型組在噴霧的第3d有向空白組方向移動(dòng)的趨勢(shì)，經(jīng)過第4d的噴霧影響，又逐漸遠(yuǎn)離空白組，并在噴霧7d達(dá)到最大值，表明該組代謝物譜變化最激烈。
　　 3.3進(jìn)一步對(duì)噴霧7d的空白組、模型組、麻黃組、杏仁組、麻杏配伍組共同進(jìn)行PCA分析。從得分圖可見，在第一主成分方向，模型組與空白組區(qū)分明顯。給藥組與同時(shí)間的模型組比較，區(qū)分明顯，3個(gè)給

13、藥組逐漸向空白組方向靠近，表明各給藥組隨時(shí)間的變化軌跡回歸空白組;其中麻杏配伍組和空白組位于第四象限，交叉重疊，難于完全區(qū)分。
　　 3.4對(duì)空白組、麻黃組、杏仁組、麻杏配伍組與模型組共同進(jìn)行PLS-DA分析，獲得了表征各給藥組與模型組差異的生物標(biāo)志物，包括有機(jī)酸、脂肪酸、氨基酸與胺類等?？瞻捉M與模型組比較，生物標(biāo)志物水平顯著下調(diào)的有甘氨酸、丙酮酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、己二酸、辛二酸、天門冬氨酸、檸檬酸、馬尿酸、苯丙氨酸;生物

14、標(biāo)志水平顯著上調(diào)的有正丙胺。麻黃組與模型組比較，生物標(biāo)志物水平顯著下調(diào)的有甘氨酸、蘋果酸、己二酸、辛二酸、天門冬氨酸、檸檬酸、馬尿酸、苯丙氨酸。杏仁組與與模型組比較，生物標(biāo)志物水平顯著下調(diào)的有甘氨酸、丙酮酸、蘋果酸、己二酸、馬尿酸、苯丙氨酸;麻杏配伍組與模型組比較，生物標(biāo)志物水平顯著下調(diào)的有丁二酸、甘氨酸、丙酮酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、己二酸、辛二酸、天門冬氨酸、檸檬酸、馬尿酸、苯丙氨酸。
　　 結(jié)論：
　　 1化學(xué)成分

15、分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:麻黃與杏仁配伍后，與麻黃單煎液相比，當(dāng)杏仁的配伍比例增至麻黃2倍時(shí)，麻黃-杏仁合煎液中5種麻黃堿的含量發(fā)生顯著性變化(P＜0.05)。與杏仁單煎液相比，不同比例的麻黃與杏仁配伍后，其水煎液的苦杏仁苷含量均高于單味杏仁水煎液。
　　 2苦杏仁藥材用95％乙醇回流提取僅得到D-苦杏仁苷，而將苦杏仁藥材進(jìn)行水煎煮提取即可得到L-苦杏仁苷和D-苦杏仁苷。隨著煎煮溫度的上升，苦杏仁中L-苦杏仁苷與D-苦杏仁苷的峰面積比

16、值逐漸增加;苦杏仁苷單體能在酸性環(huán)境中穩(wěn)定存在，而堿是導(dǎo)致其發(fā)生異構(gòu)的因素之一。
　　 3從生物標(biāo)志物的變化趨勢(shì)表可看出:(1)給藥后哮喘大鼠的糖酵解途徑回調(diào)，表現(xiàn)在與三羧酸循環(huán)、糖酵解能量代謝密切相關(guān)的檸檬酸、丁二酸、蘋果酸等內(nèi)源性代謝中間產(chǎn)物含量的變化。(2)給藥后哮喘大鼠的氨基酸代謝回調(diào)，表現(xiàn)在天門冬氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸等氨基酸水平的變化。(3)給藥后哮喘大鼠的脂肪酸代謝回調(diào)，表現(xiàn)在丙酮酸、己二酸等脂肪酸代謝水平的變化。

17、
　　 4目前中藥復(fù)方的成分復(fù)雜，代謝途徑不明確，我們尚不能說明中藥發(fā)揮藥效修復(fù)代謝網(wǎng)絡(luò)與代謝產(chǎn)物之間明確的關(guān)聯(lián)性。麻杏配伍組的代謝狀態(tài)比單味麻黃組和單味杏仁組更接近空白組，這從代謝組學(xué)的角度佐證了麻黃-杏仁配伍可使藥效增強(qiáng);單味麻黃組、單味杏仁組、麻杏配伍組在一定程度上改善了卵蛋白致敏哮喘大鼠全身異常的代謝狀態(tài)。通過整體調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝與糖代謝，其中麻杏配伍組的生物標(biāo)志物回調(diào)程度最大，表明麻黃-杏仁配伍干預(yù)卵蛋白致敏癥候模型