麻黃—白術(shù)藥對(duì)主要化學(xué)成分、藥效及尿液代謝物研究.pdf

1、研究背景與意義：
　　 藥對(duì)，又稱(chēng)對(duì)藥，由兩味藥成對(duì)，個(gè)別由三味以上藥組成，是臨床上常用的相對(duì)固定的配伍形式。藥對(duì)組成形式主要是在七情配伍的基礎(chǔ)上，以一定證候特點(diǎn)及采用相應(yīng)治法為前提，根據(jù)藥物的性味歸經(jīng)、升降浮沉，選擇性地將兩味或兩味以上的中藥進(jìn)行配對(duì)，其配伍蘊(yùn)涵著豐富的客觀規(guī)律。藥對(duì)的配伍規(guī)律是基于中醫(yī)藥理論體系，能體現(xiàn)疾病證型、病機(jī)及藥物特點(diǎn)而配合應(yīng)用的藥物間的聯(lián)系，它是歷代醫(yī)家的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，并經(jīng)歷了從感性認(rèn)識(shí)到理性認(rèn)識(shí)的飛躍

2、，具有普遍性、重復(fù)性的特點(diǎn)。
　　 我們進(jìn)行藥對(duì)組成規(guī)律研究的意義:(1)進(jìn)一步揭示藥對(duì)配伍的客觀規(guī)律與科學(xué)內(nèi)涵，闡明藥對(duì)配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)理，在更廣的范圍、更深的層次展現(xiàn)中醫(yī)治療疾病的科學(xué)原理。(2)指導(dǎo)臨床遣方用藥，既能更有效地運(yùn)用已有的藥對(duì)，亦利于針對(duì)疾病譜的變化、病證的發(fā)展而創(chuàng)制新藥對(duì)。(3)隨著藥對(duì)的作用機(jī)理與物質(zhì)基礎(chǔ)更加明確，在新藥研究中以有效成分或有效部位配伍已越來(lái)越多，中西藥配伍亦不鮮見(jiàn)，傳統(tǒng)配伍的普遍規(guī)律同

3、樣可以指導(dǎo)新的配伍形式，對(duì)中藥新產(chǎn)品制劑處方研創(chuàng)具有現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本藥對(duì)組成規(guī)律研究遵循中醫(yī)藥的“理法方藥”診療理論，選擇麻黃加術(shù)湯及麻黃-白術(shù)藥對(duì)為研究對(duì)象，按性味的“七情合和”配伍，以藥味配比量為切入點(diǎn)，將藥對(duì)配伍研究分解為:(1)藥對(duì)配伍前后的體外化學(xué)成分變化研究。(2)主要藥理效應(yīng)（毒性）比較研究。(3)藥對(duì)配伍對(duì)代謝組生物信息干預(yù)的研究。(4)運(yùn)用解析多變量復(fù)雜關(guān)系的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析。通過(guò)麻黃-白術(shù)藥對(duì)配伍、化

4、學(xué)成分變化、藥理效應(yīng)改變、體內(nèi)代謝途徑與機(jī)制幾者間的內(nèi)在聯(lián)系，揭示藥對(duì)的組成規(guī)律，據(jù)此為中醫(yī)臨床遣方用藥、創(chuàng)制新藥對(duì)及開(kāi)發(fā)新藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：
　　 通過(guò)比較麻黃與白術(shù)不同配伍配比對(duì)水煎液中有效成分含量的影響，探求麻黃與白術(shù)藥對(duì)的化學(xué)變化規(guī)律。以期從物質(zhì)基礎(chǔ)的變化來(lái)闡述藥理效應(yīng)變化的內(nèi)因。
　　 通過(guò)比較麻黃與白術(shù)不同配伍配比對(duì)急性毒性、發(fā)汗作用、鎮(zhèn)痛作用、利尿作用的影響，定量評(píng)價(jià)麻黃和白術(shù)配伍

5、后主要藥理效應(yīng)的變化，以判斷藥物是否增效減毒。
　　 通過(guò)運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)探討大鼠灌胃麻黃、白術(shù)和麻黃-白術(shù)藥對(duì)配伍后對(duì)尿液中生物標(biāo)志物的影響，尋找表征這一變化過(guò)程的生物標(biāo)志物，從系統(tǒng)與整體層面探討麻黃配伍白術(shù)的相互作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.麻黃-白術(shù)藥對(duì)不同配伍配比的體外化學(xué)成分研究分析在制備過(guò)程（體外）中化學(xué)成分?jǐn)?shù)和量的變化，探討麻黃、白術(shù)主要效應(yīng)成分在制備過(guò)程中的理化變化和相互影響。
　　

6、 采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)考察麻黃水煎液及麻黃-白術(shù)藥對(duì)不同配比共煎液中麻黃類(lèi)生物堿（麻黃堿、偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、去甲基偽麻黃堿和甲基麻黃堿）含量的變化情況;采用高效液相色譜法(HPLC）考察白術(shù)水煎液及麻黃-白術(shù)藥對(duì)不同配比共煎液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的指紋圖譜峰的變化情況。比較麻黃與白術(shù)不同比例配伍前后水煎液中有效成分含量的變化。2.麻黃-白術(shù)藥對(duì)不同配比的主要藥理效應(yīng)（主證）比較研究以毒副作用、發(fā)汗作用、鎮(zhèn)痛作

7、用、利尿作用、藥物相互作用等相關(guān)指標(biāo)，從藥理效應(yīng)相互關(guān)系方面分析藥對(duì)配伍（偶合）對(duì)靶標(biāo)效應(yīng)強(qiáng)度的規(guī)律。
　　 急性毒性實(shí)驗(yàn)及相互作用研究采用昆明小鼠，按照麻黃、白術(shù)、麻黃白術(shù)(3∶2)、麻黃白術(shù)(3∶4)、麻黃白術(shù)(3∶8)分為5個(gè)給藥組，采用小鼠半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)麻黃、白術(shù)及麻黃-白術(shù)藥對(duì)三個(gè)配比的急性毒性，無(wú)法測(cè)得LD50值的，采用測(cè)定其最大耐受量(MTD)的方法以獲取其安全性信息。
　　 發(fā)汗藥效實(shí)驗(yàn)

8、研究采用SD大鼠，通過(guò)比較大鼠腋窩部和足趾部皮膚汗腺，確定了取材部位，建立了定量評(píng)價(jià)發(fā)汗強(qiáng)度的方法。采用汗腺導(dǎo)管面積為指標(biāo)考察了麻黃-白術(shù)藥對(duì)配伍對(duì)大鼠的發(fā)汗作用。
　　 鎮(zhèn)痛藥效實(shí)驗(yàn)研究采用昆明小鼠，運(yùn)用熱板鎮(zhèn)痛和光輻射熱甩尾鎮(zhèn)痛法，考察麻黃、白術(shù)、麻黃-白術(shù)藥對(duì)及麻黃加術(shù)湯全方的鎮(zhèn)痛作用;依據(jù)中效原理(Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法)，應(yīng)用Calcusyn統(tǒng)計(jì)軟件(Biosoft，USA)分析，繪制單味藥及二藥配伍使用對(duì)

9、小鼠痛閾的影響曲線，確定二藥的效應(yīng)(fa)-合用指數(shù)(CI)的關(guān)系，根據(jù)曲線定量評(píng)價(jià)麻黃與白術(shù)鎮(zhèn)痛的相互作用
　　 利尿藥效實(shí)驗(yàn)研究采用SD大鼠，運(yùn)用水負(fù)荷排尿?qū)嶒?yàn)-代謝籠法，考察麻黃、白術(shù)、麻黃-白術(shù)藥對(duì)大鼠的利尿作用;采用昆明小鼠，運(yùn)用濾紙稱(chēng)重法，考察麻黃、白術(shù)、麻黃-白術(shù)藥對(duì)小鼠的利尿作用，探索藥對(duì)配伍對(duì)于利尿作用的影響。
　　 3.麻黃-白術(shù)藥對(duì)配伍的代謝組學(xué)研究選用SD大鼠40只，雄性，隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照

10、組、麻黃組、白術(shù)組和麻黃白術(shù)3∶4組，每組10只。生理鹽水、麻黃水煎液、白術(shù)水煎液、麻黃-白術(shù)藥對(duì)水煎液給大鼠灌胃，每天收集8h尿液，尿液離心后衍生化。采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定各組大鼠尿液代謝物譜。將所得的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行峰識(shí)別、峰對(duì)齊、扣除溶劑峰、雜質(zhì)峰的處理。導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積歸一化處理，生成二維矩陣。將矩陣導(dǎo)入模式識(shí)別軟件Simca-P12.0進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，分析麻黃組、白術(shù)組

11、、麻黃-白術(shù)藥對(duì)組生物標(biāo)志物的差異及水平變化。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 運(yùn)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組均數(shù)比較采用單向方差分析(One-wayANOVA)，方差齊性采用LSD法;方差不齊，Welch法校正后采用Games-Howell法多重比較。所有檢驗(yàn)水平α=0.05(雙側(cè))。
　　 結(jié)果：
　　 1.麻黃-白術(shù)藥對(duì)不

12、同配伍配比的體外化學(xué)成分研究
　　 與麻黃單煎液相比，麻黃白術(shù)配伍后，隨著白術(shù)的配伍比例增大，水煎液中去甲基偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿含量均有所下降。
　　 與白術(shù)單煎液相比，麻黃白術(shù)配伍后，水煎液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ均有不同程度的降低。
　　 2.麻黃-白術(shù)藥對(duì)不同配伍配比主要藥理效應(yīng)（主證）比較研究
　　 急性毒性實(shí)驗(yàn)麻黃LD50值為79.098 g·kg-1

13、，白術(shù)和三個(gè)藥對(duì)配伍組均無(wú)法測(cè)得LD50值，均測(cè)得其最大耐受量(MTD)，白術(shù)三個(gè)配伍組及全方配伍均對(duì)麻黃的毒性具有拮抗作用。
　　 發(fā)汗藥效實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物的選擇，以大鼠為優(yōu)，取材部位選取足趾部皮膚汗腺，取材時(shí)間為給藥后1h。麻黃有較好的發(fā)汗作用，白術(shù)不明顯，麻黃白術(shù)配伍后，對(duì)于麻黃的發(fā)汗效力有拮抗作用，其中以麻黃白術(shù)(3∶4)組影響最為顯著。
　　 鎮(zhèn)痛藥效實(shí)驗(yàn)與空白組相比，各給藥組均不同程度的具有提高小鼠痛閾值，抑制小

14、鼠甩尾的作用，說(shuō)明單味麻黃、單味白術(shù)及麻黃白術(shù)配伍后均具有鎮(zhèn)痛作用，在相同劑量時(shí)，效應(yīng)強(qiáng)弱順序?yàn)槁辄S白術(shù)(3∶4)組＞白術(shù)組＞麻黃組;與單味藥相比，麻黃白術(shù)配伍后鎮(zhèn)痛作用有所增強(qiáng)，說(shuō)明麻黃、白術(shù)配伍后，鎮(zhèn)痛作用為協(xié)同作用。
　　 利尿藥效實(shí)驗(yàn)大鼠的代謝籠法及小鼠的濾紙稱(chēng)重法實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，麻黃-白術(shù)藥對(duì)配伍能增加正常大鼠及正常小鼠排尿量，與單味藥材相比，藥對(duì)配伍使其利尿效應(yīng)增強(qiáng)。
　　 3.代謝組學(xué)研究
　　 與

15、空白對(duì)照組比較，白術(shù)組存在差異的生物標(biāo)志物有:正丙胺、α-酮戊二酸、己二酸、檸檬酸、馬尿酸、色氨酸、甲基黃嘌呤、酪氨酸;麻黃組與空白對(duì)照組存在差異的生物標(biāo)志物有:正丙胺、馬尿酸、丙氨酸、色氨酸;麻黃白術(shù)(3∶4)組與空白對(duì)照組存在差異的生物標(biāo)志物有:正丙胺、α-酮戊二酸、己二酸、檸檬酸、馬尿酸、半胱氨酸、烏頭酸、丙氨酸、氨基馬尿酸、甲基黃嘌呤、酪氨酸、色氨酸。與空白對(duì)照組比較，生物標(biāo)志物水平顯著下調(diào)的有:正丙胺、α-酮戊二酸、己二酸、檸

16、檬酸、馬尿酸;生物標(biāo)志水平顯著上調(diào)的有:半胱氨酸、烏頭酸、丙氨酸、氨基馬尿酸、甲基黃嘌呤、酪氨酸、色氨酸。
　　 結(jié)論：
　　 1化學(xué)成分分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，麻黃與白術(shù)配伍后，麻黃中各有效成分的溶出率明顯減少，其溶出率與白術(shù)在藥對(duì)中所占的比例有關(guān)，比例越大，麻黃堿類(lèi)成分溶出率越小;藥對(duì)配伍后，白術(shù)中各有效成分的溶出率與白術(shù)單煎液相比也明顯減少，麻黃白術(shù)配伍后對(duì)彼此有效成分的溶出有一定的抑制作用。
　　 2藥對(duì)配伍使

17、用多起到增效減毒的作用。結(jié)合急性毒性實(shí)驗(yàn)、發(fā)汗實(shí)驗(yàn)、鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)、利尿?qū)嶒?yàn)等研究結(jié)果，對(duì)麻黃-白術(shù)藥對(duì)不同配伍配比進(jìn)行分析。麻黃白術(shù)配伍使用后，對(duì)麻黃的毒性有拮抗作用，發(fā)汗作用有拮抗作用，鎮(zhèn)痛作用有協(xié)同作用，利尿作用有協(xié)同作用。其中麻黃白術(shù)(3∶4)配伍的減毒增效作用十分明顯。這與經(jīng)方麻黃加術(shù)湯中麻黃和白術(shù)的配伍比例相吻合。
　　 3藥對(duì)配伍對(duì)大鼠尿液代謝標(biāo)志物的影響
　　 麻黃、白術(shù)單味藥影響的代謝標(biāo)志物不同，麻黃-白術(shù)藥