新型熒光衍生法測定細胞凋亡關鍵酶活性.pdf

1、細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象,在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用。它在生物體的進化、內環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。盡管凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚,但是已經確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用,細胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程,到目前為止,至少已有14種Caspase被發(fā)現,Caspase分子間的同源性很高,結構相似,都是半

2、胱氨酸家族蛋白酶。Caspase酶是細胞凋亡關鍵酶,因此其活性檢測就成為判斷細胞凋亡程度的重要標準。最近,我們課題組發(fā)現多肽能夠與兒茶酚和高碘酸鈉在pH7.5進行縮合反應,形成單一的熒光產物,激發(fā)最大波長在390nm附近,發(fā)射波長在490nm左右。更為重要的是,自由氨基酸、葡萄糖和半乳糖等糖類化合物、精胺等多胺化合物以及DNA堿基如腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶等相同反應條件下均不產生熒光。因此,新型熒光衍生方法檢測caspase酶的

3、活性專屬性強,操作簡便,利于推廣,具有一定的應用前景。
　　課題第一部分首先對寡肽熒光衍生條件進行了優(yōu)化,在此基礎上再對高效液相分析條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的熒光衍生體系為:供試液100μL,兒茶酚(10mmol/L)100μL,高碘酸鈉(12mmol/L)50μL,硼酸(300mmol/L,pH7.0)50μL,加熱溫度120℃,加熱時間10min。優(yōu)化后的色譜條件為:色譜柱:CAPCELLPAKC18MGS5(5um,150mm

4、X4.6mmI.D.);流動相:A(250mmol/L硼酸,氫氧化鈉調pH值到7.5,20％):B(水,80-0%):C(甲醇,0-80%)(v/v/v),梯度時間40min;流速為1.0mL/min;柱溫:30℃;熒光檢測波長:激發(fā)波長390nm,發(fā)射波長490nm;進樣量:20μL。
　　課題第二部分用新型熒光衍生方法測定亮氨酸腦啡肽并與紫外檢測方法、OPA衍生法進行了比較。亮氨酸腦啡肽是一種非常重要的內源肽,其氨基酸順序和結

5、構為:酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)。體外試驗中,保留時間為25min,線性范圍為0.5～50.0mg/L(r=0.9999),最低定量限為0.25mg/L;模擬血漿實驗中,內源物質不干擾測定,線性范圍為0.5～50.0mg/L(r=0.9998),最低定量限為0.5mg/L。血漿中內源性干擾物質多,紫外檢測方法和OPA衍生法都不能有效檢測亮氨酸腦啡肽的含量。
　　課題第三部分是本

6、課題重點,利用新型熒光衍生方法來檢測兩種細胞系人宮頸癌細胞(Hela細胞)和人肺腺癌細胞(A549細胞)受誘導凋亡后的caspase-3和caspase-8的活性。每種細胞系均采用三種誘導凋亡方法:低溫輔助紫外照射誘導凋亡,絲裂霉素C誘導凋亡和喜樹堿誘導凋亡。Caspase酶底物設計為在特異識別序列N端加上具有親水性氨基酸絲氨酸,這可以增加底物水溶性,N端延長序列同時能增加底物專屬性,C端加上實驗證明衍生效率較高的兩種寡肽片段LG和AL