Brg1和Brm對CAMs和ET-1的轉錄調控及其在低氧性肺動脈高壓中的作用和機制研究.pdf

1、研究背景:
　　低氧性肺動脈高壓(Hypoxia Pulmonary Hypertension,HPH)是由低氧引起的以持續(xù)肺動脈壓力增高、肺血管結構改建,并伴有右心室肥大的慢性進行性疾病,是高原心臟病和肺源性心臟病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。HPH的形成是一個復雜的病理生理過程,已有研究表明,炎癥免疫反應和血管活性物質分泌失調是其中的兩個重要機制。炎癥免疫細胞在血管壁的黏附聚集是炎癥發(fā)生的起始環(huán)節(jié),而血管內(nèi)皮細胞中 ICAM-1、VCAM-

2、1和E-selectin等細胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)是其中的關鍵作用分子。低氧時內(nèi)皮細胞中CAMs基因轉錄激活,促進循環(huán)免疫細胞的黏附聚集和血管周圍炎癥微環(huán)境的形成,引起肺動脈高壓和肺血管結構改建。內(nèi)皮素1(Endothelin1,ET-1)是內(nèi)皮細胞分泌的縮血管作用最強的活性多肽,低氧可誘導ET-1表達上調,參與HPH的發(fā)生。目前已知,CAMs和ET-1基因表達受核因子kB(Nuclear

3、 factor kappa B,NF-kB)、低氧誘導因子1α(Hypoxia inducible factor1α,HIF-1α)和巨核細胞性白血病因子1(Megakaryocytic leukemia1,MKL1)等轉錄因子調節(jié)。低氧時上述轉錄因子進入核內(nèi)增多,與啟動子序列特異結合,啟動基因轉錄和表達。
　　真核細胞的 DNA由組蛋白包裹形成核小體乃至染色體,基因轉錄時首先需要打開核小體結構,暴露啟動子序列,即染色質重構。Br

4、ahma-related gene1(Brg1)和brahma(Brm)是哺乳動物染色質重構復合物SWI(mating-type switching)/SNF(sucrose fermentation)的核心ATP酶亞單位,兩者結構相似、功能互補。Brg1和Brm可以水解ATP釋放能量實現(xiàn)對核小體的重排和置換,從而調節(jié)靶基因的轉錄。研究表明,Brg1和Brm在胚胎發(fā)育過程中的血管平衡維持和應激相關疾病發(fā)生中都具有重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn),

5、HIF-1α可以招募Brg1和Brm至其靶基因,參與細胞低氧反應,但Brg1和Brm是否及如何參與低氧誘導的CAMs及ET-1轉錄調控,進而促進HPH的發(fā)生和發(fā)展,迄今未見報道。
　　因此,本研究在明確低氧誘導肺血管及內(nèi)皮細胞中Brg1和Brm基因表達的基礎上,研究其對內(nèi)皮細胞CAMs和ET-1轉錄調控的作用及機制;特異干擾內(nèi)皮細胞中的Brg1和Brm,進一步探討B(tài)rg1和Brm在肺血管結構改建和HPH形成中的作用和機制。為干預或

6、預防HPH提供新的思路和有效靶點。
　　方法:
　　1.模擬海拔5000m高原28d復制雄性SD大鼠HPH模型,分離肺動脈;將人肺動脈內(nèi)皮細胞(Human pulmonary arterial endothelial cell,HPEC)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)低氧(1％O2)處理24h;RT-qPCR及WB法檢測肺動脈及內(nèi)皮細胞中Brg1和

7、Brm基因的mRNA及蛋白表達。
　　2.通過外源性質粒轉染內(nèi)皮細胞(HPEC、HUVEC)過表達或siRNA轉染干擾內(nèi)源性的Brg1和Brm基因,采用報告基因法檢測CAMs啟動子轉錄活性;采用RT-qPCR及WB方法檢測CAMs基因的mRNA及蛋白表達;采用細胞黏附實驗檢測內(nèi)皮細胞的黏附功能。為了進一步探討低氧時Brg1和Brm激活CAMs轉錄的機制,采用染色質免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitatio

8、n,CHIP)方法檢測低氧后Brg1和Brm與內(nèi)皮細胞中CAMs啟動子的結合水平;siRNA轉染干擾Brg1和Brm后,進一步運用CHIP方法檢測NF-kB/p65與CAMs啟動子的結合水平,同時運用CHIP方法檢測CAMs啟動子周圍AcH3和H3K4M3等組蛋白修飾變化。
　　3.內(nèi)皮細胞(HPEC、HUVEC)中外源性質粒轉染過表達或siRNA干擾內(nèi)源性的Brg1和 Brm基因,采用報告基因法檢測 ET-1啟動子的轉錄活性;采

9、用 RT-qPCR及ELISA法檢測ET-1的mRNA表達;采用CHIP方法檢測低氧后特異結合在內(nèi)皮細胞(HUVEC) ET-1啟動子上的Brg1和Brm以及MKL1蛋白水平;siRNA轉染干擾Brg1和Brm后,采用CHIP方法檢測ET-1啟動子周圍AcH3和H3K4M3等組蛋白修飾變化。
　　4.將雄性C57/BL6小鼠隨機分為常氧組、低氧組、低氧對照病毒組和低氧Brg1/Brm干擾病毒組。常氧組和低氧組給予生理鹽水,低氧對照

10、病毒組給予對照病毒液,低氧Brg1/Brm干擾病毒組尾靜脈注射內(nèi)皮細胞特異性Brg1/Brm干擾質粒慢病毒敲減Brg1和Brm基因表達;低氧各組置于低壓氧艙內(nèi)模擬海拔5000m低氧處理28d復制小鼠HPH模型。采用導管法檢測右心室血流動力學指標;采用HE染色及免疫組化(Immunohistochemisty, IHC)染色檢測肺血管改建,采用免疫熒光(Immunofluorescence,IF)法檢測肺血管內(nèi)皮細胞中Brg1和Brm的表

11、達以及肺血管周圍炎癥細胞浸潤;采用RT-qPCR法檢測肺組織中CAMs的表達;采用ELISA法檢測肺組織勻漿IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α等炎癥因子的表達;采用CHIP法檢測低氧后肺組織中Brg1和Brm與ICAM-1啟動子的結合水平。
　　結果:
　　1.低氧可顯著上調SD大鼠的肺動脈(5000m,28d)和內(nèi)皮細胞(HPEC、HUVEC,1%O2,24h) Brg1和Brm的mRNA和蛋白表達。
　　

12、2.內(nèi)皮細胞(HPEC、HUVEC)中過表達Brg1和Brm能顯著增強低氧(1%O2,24h)誘導的CAMs啟動子轉錄活性,且該作用依賴于其酶催化活性;過表達Brg1和Brm顯著上調內(nèi)皮細胞中內(nèi)源性CAMs的mRNA和蛋白表達;敲減Brg1和Brm基因可顯著抑制低氧誘導的CAMs啟動子轉錄活性增強和內(nèi)皮細胞內(nèi)源性CAMs表達,且內(nèi)皮細胞與白細胞的黏附作用降低。CHIP實驗顯示低氧能顯著增加Brg1和Brm在內(nèi)皮細胞CAMs啟動子上p65

13、的結合區(qū)域的結合;干擾內(nèi)皮細胞中的Brg1和Brm能顯著抑制p65與CAMs啟動子的結合,CAMs啟動子周圍AcH3和H3K4Me3等具有轉錄活化作用的組蛋白也顯著減少,Pol II的招募也顯著減少。
　　3.內(nèi)皮細胞(HUVEC)中過表達Brg1和Brm能顯著增強低氧誘導的ET-1啟動子轉錄活性,酶失活的Brg1和Brm并不增強ET-1啟動子轉錄活性;干擾內(nèi)皮細胞(HPEC、HUVEC)中的Brg1和Brm能顯著抑制ET-1啟動

14、子的轉錄活性以及ET-1的表達和分泌;CHIP實驗發(fā)現(xiàn)低氧能顯著增加Brg1和Brm以及MKL1在內(nèi)皮細胞(HUVEC) ET-1啟動子上的結合;干擾Brg1和Brm后,ET-1啟動子周圍AcH3和H3K4Me3等具有轉錄活化作用的組蛋白也顯著減少。
　　4.成功構建HPH小鼠模型,IF結果顯示干擾病毒組小鼠肺血管內(nèi)皮細胞中Brg1和Brm的表達顯著降低;伴隨著肺血管內(nèi)皮細胞中Brg1和Brm的表達抑制,肺組織中CAMs基因的mR

15、NA表達也顯著降低,小鼠右心室收縮壓和肥厚指數(shù)也顯著降低,肺血管厚度顯著變薄,肺血管重構顯著改善,肺血管周圍炎癥細胞浸潤顯著減少,肺組織勻漿中 IL-1β、IL-6、MCP-1的分泌顯著降低。CHIP結果顯示 HPH小鼠肺組織中的Brg1和Brm被更多的招募到ICAM-1的啟動子上。
　　結論:
　　1. HPH大鼠肺血管中Brg1和Brm基因表達增多,內(nèi)皮細胞可能是其中一種重要效應細胞;
　　2. Brg1和Brm介

16、導低氧內(nèi)皮細胞中CAMs轉錄和表達,參與調節(jié)低氧內(nèi)皮細胞與白細胞的黏附作用,其作用機制依賴與NF-kB/p65的相互作用,以及對CAMs啟動子周圍的組蛋白修飾的影響;
　　3. Brg1和Brm參與調控低氧內(nèi)皮細胞中ET-1轉錄和表達,其作用機制依賴與MKL1的相互作用及其對ET-1啟動子周圍組蛋白修飾的調節(jié)作用;
　　4.特異干擾HPH小鼠內(nèi)皮細胞中Brg1和Brm基因,可顯著降低右心室收縮壓、抑制肺血管重構和右心室肥厚;