Brg1和Brm對(duì)CAMs和ET-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其在低氧性肺動(dòng)脈高壓中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　低氧性肺動(dòng)脈高壓(Hypoxia Pulmonary Hypertension,HPH)是由低氧引起的以持續(xù)肺動(dòng)脈壓力增高、肺血管結(jié)構(gòu)改建,并伴有右心室肥大的慢性進(jìn)行性疾病,是高原心臟病和肺源性心臟病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。HPH的形成是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程,已有研究表明,炎癥免疫反應(yīng)和血管活性物質(zhì)分泌失調(diào)是其中的兩個(gè)重要機(jī)制。炎癥免疫細(xì)胞在血管壁的黏附聚集是炎癥發(fā)生的起始環(huán)節(jié),而血管內(nèi)皮細(xì)胞中 ICAM-1、VCAM-

2、1和E-selectin等細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)是其中的關(guān)鍵作用分子。低氧時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞中CAMs基因轉(zhuǎn)錄激活,促進(jìn)循環(huán)免疫細(xì)胞的黏附聚集和血管周?chē)装Y微環(huán)境的形成,引起肺動(dòng)脈高壓和肺血管結(jié)構(gòu)改建。內(nèi)皮素1(Endothelin1,ET-1)是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的縮血管作用最強(qiáng)的活性多肽,低氧可誘導(dǎo)ET-1表達(dá)上調(diào),參與HPH的發(fā)生。目前已知,CAMs和ET-1基因表達(dá)受核因子kB(Nuclear

3、 factor kappa B,NF-kB)、低氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia inducible factor1α,HIF-1α)和巨核細(xì)胞性白血病因子1(Megakaryocytic leukemia1,MKL1)等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)。低氧時(shí)上述轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入核內(nèi)增多,與啟動(dòng)子序列特異結(jié)合,啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
　　真核細(xì)胞的 DNA由組蛋白包裹形成核小體乃至染色體,基因轉(zhuǎn)錄時(shí)首先需要打開(kāi)核小體結(jié)構(gòu),暴露啟動(dòng)子序列,即染色質(zhì)重構(gòu)。Br

4、ahma-related gene1(Brg1)和brahma(Brm)是哺乳動(dòng)物染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物SWI(mating-type switching)/SNF(sucrose fermentation)的核心ATP酶亞單位,兩者結(jié)構(gòu)相似、功能互補(bǔ)。Brg1和Brm可以水解ATP釋放能量實(shí)現(xiàn)對(duì)核小體的重排和置換,從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明,Brg1和Brm在胚胎發(fā)育過(guò)程中的血管平衡維持和應(yīng)激相關(guān)疾病發(fā)生中都具有重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn),

5、HIF-1α可以招募Brg1和Brm至其靶基因,參與細(xì)胞低氧反應(yīng),但Brg1和Brm是否及如何參與低氧誘導(dǎo)的CAMs及ET-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控,進(jìn)而促進(jìn)HPH的發(fā)生和發(fā)展,迄今未見(jiàn)報(bào)道。
　　因此,本研究在明確低氧誘導(dǎo)肺血管及內(nèi)皮細(xì)胞中Brg1和Brm基因表達(dá)的基礎(chǔ)上,研究其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞CAMs和ET-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用及機(jī)制;特異干擾內(nèi)皮細(xì)胞中的Brg1和Brm,進(jìn)一步探討B(tài)rg1和Brm在肺血管結(jié)構(gòu)改建和HPH形成中的作用和機(jī)制。為干預(yù)或

6、預(yù)防HPH提供新的思路和有效靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.模擬海拔5000m高原28d復(fù)制雄性SD大鼠HPH模型,分離肺動(dòng)脈;將人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human pulmonary arterial endothelial cell,HPEC)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)低氧(1％O2)處理24h;RT-qPCR及WB法檢測(cè)肺動(dòng)脈及內(nèi)皮細(xì)胞中Brg1和

7、Brm基因的mRNA及蛋白表達(dá)。
　　2.通過(guò)外源性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞(HPEC、HUVEC)過(guò)表達(dá)或siRNA轉(zhuǎn)染干擾內(nèi)源性的Brg1和Brm基因,采用報(bào)告基因法檢測(cè)CAMs啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性;采用RT-qPCR及WB方法檢測(cè)CAMs基因的mRNA及蛋白表達(dá);采用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附功能。為了進(jìn)一步探討低氧時(shí)Brg1和Brm激活CAMs轉(zhuǎn)錄的機(jī)制,采用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitatio

8、n,CHIP)方法檢測(cè)低氧后Brg1和Brm與內(nèi)皮細(xì)胞中CAMs啟動(dòng)子的結(jié)合水平;siRNA轉(zhuǎn)染干擾Brg1和Brm后,進(jìn)一步運(yùn)用CHIP方法檢測(cè)NF-kB/p65與CAMs啟動(dòng)子的結(jié)合水平,同時(shí)運(yùn)用CHIP方法檢測(cè)CAMs啟動(dòng)子周?chē)鶤cH3和H3K4M3等組蛋白修飾變化。
　　3.內(nèi)皮細(xì)胞(HPEC、HUVEC)中外源性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)或siRNA干擾內(nèi)源性的Brg1和 Brm基因,采用報(bào)告基因法檢測(cè) ET-1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性;采

9、用 RT-qPCR及ELISA法檢測(cè)ET-1的mRNA表達(dá);采用CHIP方法檢測(cè)低氧后特異結(jié)合在內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC) ET-1啟動(dòng)子上的Brg1和Brm以及MKL1蛋白水平;siRNA轉(zhuǎn)染干擾Brg1和Brm后,采用CHIP方法檢測(cè)ET-1啟動(dòng)子周?chē)鶤cH3和H3K4M3等組蛋白修飾變化。
　　4.將雄性C57/BL6小鼠隨機(jī)分為常氧組、低氧組、低氧對(duì)照病毒組和低氧Brg1/Brm干擾病毒組。常氧組和低氧組給予生理鹽水,低氧對(duì)照

10、病毒組給予對(duì)照病毒液,低氧Brg1/Brm干擾病毒組尾靜脈注射內(nèi)皮細(xì)胞特異性Brg1/Brm干擾質(zhì)粒慢病毒敲減Brg1和Brm基因表達(dá);低氧各組置于低壓氧艙內(nèi)模擬海拔5000m低氧處理28d復(fù)制小鼠HPH模型。采用導(dǎo)管法檢測(cè)右心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo);采用HE染色及免疫組化(Immunohistochemisty, IHC)染色檢測(cè)肺血管改建,采用免疫熒光(Immunofluorescence,IF)法檢測(cè)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中Brg1和Brm的表

11、達(dá)以及肺血管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn);采用RT-qPCR法檢測(cè)肺組織中CAMs的表達(dá);采用ELISA法檢測(cè)肺組織勻漿IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α等炎癥因子的表達(dá);采用CHIP法檢測(cè)低氧后肺組織中Brg1和Brm與ICAM-1啟動(dòng)子的結(jié)合水平。
　　結(jié)果:
　　1.低氧可顯著上調(diào)SD大鼠的肺動(dòng)脈(5000m,28d)和內(nèi)皮細(xì)胞(HPEC、HUVEC,1%O2,24h) Brg1和Brm的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　

12、2.內(nèi)皮細(xì)胞(HPEC、HUVEC)中過(guò)表達(dá)Brg1和Brm能顯著增強(qiáng)低氧(1%O2,24h)誘導(dǎo)的CAMs啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,且該作用依賴(lài)于其酶催化活性;過(guò)表達(dá)Brg1和Brm顯著上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性CAMs的mRNA和蛋白表達(dá);敲減Brg1和Brm基因可顯著抑制低氧誘導(dǎo)的CAMs啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)源性CAMs表達(dá),且內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附作用降低。CHIP實(shí)驗(yàn)顯示低氧能顯著增加Brg1和Brm在內(nèi)皮細(xì)胞CAMs啟動(dòng)子上p65

13、的結(jié)合區(qū)域的結(jié)合;干擾內(nèi)皮細(xì)胞中的Brg1和Brm能顯著抑制p65與CAMs啟動(dòng)子的結(jié)合,CAMs啟動(dòng)子周?chē)鶤cH3和H3K4Me3等具有轉(zhuǎn)錄活化作用的組蛋白也顯著減少,Pol II的招募也顯著減少。
　　3.內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中過(guò)表達(dá)Brg1和Brm能顯著增強(qiáng)低氧誘導(dǎo)的ET-1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,酶失活的Brg1和Brm并不增強(qiáng)ET-1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性;干擾內(nèi)皮細(xì)胞(HPEC、HUVEC)中的Brg1和Brm能顯著抑制ET-1啟動(dòng)

14、子的轉(zhuǎn)錄活性以及ET-1的表達(dá)和分泌;CHIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低氧能顯著增加Brg1和Brm以及MKL1在內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC) ET-1啟動(dòng)子上的結(jié)合;干擾Brg1和Brm后,ET-1啟動(dòng)子周?chē)鶤cH3和H3K4Me3等具有轉(zhuǎn)錄活化作用的組蛋白也顯著減少。
　　4.成功構(gòu)建HPH小鼠模型,IF結(jié)果顯示干擾病毒組小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中Brg1和Brm的表達(dá)顯著降低;伴隨著肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中Brg1和Brm的表達(dá)抑制,肺組織中CAMs基因的mR

15、NA表達(dá)也顯著降低,小鼠右心室收縮壓和肥厚指數(shù)也顯著降低,肺血管厚度顯著變薄,肺血管重構(gòu)顯著改善,肺血管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少,肺組織勻漿中 IL-1β、IL-6、MCP-1的分泌顯著降低。CHIP結(jié)果顯示 HPH小鼠肺組織中的Brg1和Brm被更多的招募到ICAM-1的啟動(dòng)子上。
　　結(jié)論:
　　1. HPH大鼠肺血管中Brg1和Brm基因表達(dá)增多,內(nèi)皮細(xì)胞可能是其中一種重要效應(yīng)細(xì)胞;
　　2. Brg1和Brm介

16、導(dǎo)低氧內(nèi)皮細(xì)胞中CAMs轉(zhuǎn)錄和表達(dá),參與調(diào)節(jié)低氧內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附作用,其作用機(jī)制依賴(lài)與NF-kB/p65的相互作用,以及對(duì)CAMs啟動(dòng)子周?chē)慕M蛋白修飾的影響;
　　3. Brg1和Brm參與調(diào)控低氧內(nèi)皮細(xì)胞中ET-1轉(zhuǎn)錄和表達(dá),其作用機(jī)制依賴(lài)與MKL1的相互作用及其對(duì)ET-1啟動(dòng)子周?chē)M蛋白修飾的調(diào)節(jié)作用;
　　4.特異干擾HPH小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中Brg1和Brm基因,可顯著降低右心室收縮壓、抑制肺血管重構(gòu)和右心室肥厚;