含rPB-DR啟動子和TK基因的重組腺病毒的構建和鑒定及對前列腺癌細胞的作用.pdf

1、前言 多數(shù)前列腺癌患者在病程后期其癌細胞獲得雄激素非依賴性生長，這成為晚期前列腺癌難以控制的主要原因。目前研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌組織中存在兩種類型癌細胞，一類是表達雄激素受體，其在內(nèi)分泌治療失敗的前列腺癌中仍起著重要作用，許多細胞通過敏化使AR的活性大幅度提高，而獲得雄激素非依賴性生長。另一類AR表達喪失。研究發(fā)現(xiàn)：AR表達喪失癌細胞的比例越高，前列腺癌預后越差。所以，如能找到同時針對兩類前列腺細胞的治療方法，將對治療雄激素非依賴

2、性前列腺癌具有重要的意義。 目前，有關前列腺癌基因治療的治療策略很多。因為多數(shù)治療方法沒有較好的特異性，不能直接針對前列腺癌細胞，所以其臨床應用有限。 目前發(fā)現(xiàn)有兩種前列腺特異性啟動子，即PSA及rPB，兩者均含有兩個雄激素反應元件(androgen-responseelement，ARE)及一個雄激素反應區(qū)。如應用前列腺特異性啟動子，可使前列腺癌基因治療的病毒載體大量安全的復制擴增，從而達到安全高效的治療目的。但PSA

3、及rPB只對AR表達陽性的前列腺癌細胞有用，在AR表達陰性的前列腺則無任何作用。我們已經(jīng)知道無論AR表達陽性及AR表達陰性前列腺癌細胞均有維甲酸受體，因此，我們應用維甲酸反應元件替代rPB內(nèi)的雄激素反應元件，構建出對雄激素依賴及雄激素非依賴性前列腺癌細胞均有明顯作用的改良型rPB-DR啟動子，并將其與TK自殺基因相連接，以腺病毒作為載體研究其對前列腺癌細胞的殺傷作用。 第一部分含rPB-DR啟動子和TK基因的重組腺病毒的構建和鑒

4、定 目的：構建含rPB-DR啟動子和TK自殺基因的重組復制缺陷型腺病毒并進行鑒定，為前列腺癌基因治療的研究奠定基礎。 方法：應用分子克隆技術，將rPB-DR啟動子連接至pBluescriptSK-TK上構建出pBluescriptSK-rPB-DR-TK，再酶切出rPB-DR-TK目的片斷，并將其連接至穿梭質粒pShuttle上。將構建好的pShuttle-rPB-DR-TK經(jīng)PmeI酶切線性化后再以電穿孔法轉化至感受態(tài)

5、細菌E.coliBJ5183-AdEasy-1內(nèi)進行同源重組，抽提質粒經(jīng)卡那抗性篩選及酶切鑒定正確的即為pAd-rPB-DR-TK，再經(jīng)PacI酶切回收后以脂質體法轉染人胚腎293細胞，包裝出完整腺病毒，然后大量擴增測定滴度，并行PCR鑒定。 結果和討論：經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定證實成功構建了包含rPB-DR啟動子和TK自殺基因的重組復制缺陷型腺病毒pAd-rPB-DR-TK，包裝、擴增后測病毒滴度為1.1×108TCID50/

6、ml。成功構建出包含rPB-DR啟動子和TK自殺基因的重組復制缺陷型腺病毒并鑒定正確，可用于下一步前列腺癌基因治療的研究中 第二部分ADV-rPB-DR-TK對前列腺癌細胞的作用 目的：研究腺病毒載體介導的單純皰疹胸苷激酶(HSV-TK)基因/GCV(丙氧鳥苷)自殺基因治療系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的前列腺癌細胞的特異殺傷作用。 方法：利用攜帶HSV-TK基因(自殺基因)和rPB-DR啟動子的重組腺病毒ADV-rPB-DR-

7、TK，感染體外培養(yǎng)的前列腺癌細胞及其他腫瘤細胞，然后加入GCV和維甲酸治療，以MTT比色法和臺盼藍拒染色法來測定不同濃度、不同時間下HSV-TK/GCV自殺基因治療體系對前列腺癌細胞的殺傷作用。 結果和討論：ADV-rPB-DR-TK在GCV和維甲酸的誘導治療下，對前列腺癌細胞PC-3具有特異殺傷作用。實驗證實腺病毒載體可以成功的將rPB-DR-TK導入前列腺癌細胞，并利用HSV-TK/GCV體系對前列腺癌細胞進行特異的殺傷作用