組織工程脊髓研制和應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本研究旨在探討體外構(gòu)建組織工程脊髓的方法和移植治療大鼠脊髓半切塊狀損傷的療效。 方法：1．在多聚賴氨酸包被的聚乳酸一羥基乙酸(PLGA)支架上種植鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，然后加入腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化，用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察NSCs在PLGA支架上的生長和分化行為，應(yīng)用免疫組織化學(xué)鑒定PLGA支架上培養(yǎng)的細(xì)胞。2．NSCs種植在A(孔徑：200～300μm)和B(孔徑：400～500

2、μm)兩種不同孔徑的PLGA支架上培養(yǎng)5天，體外構(gòu)建出A和B兩種組織工程脊髓。取成年SD大鼠35只，制作脊髓(T<,10>)右半切4mm長塊狀缺損模型，隨機(jī)分成5組：實(shí)驗(yàn)A組損傷區(qū)移植組織工程脊髓A；實(shí)驗(yàn)B組移植組織工程脊髓B；對(duì)照C組移植NSCs；對(duì)照D組移植PLGA支架(孔徑：200～300μm)；對(duì)照E組未移植。移植治療12周，每周均行BBB肢體運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。傷后第12周行辣根過氧化物酶(HRP)神經(jīng)逆行示蹤評(píng)價(jià)脊髓傳導(dǎo)束的恢復(fù)程

3、度，并取損傷處脊髓組織行神經(jīng)軸索免疫組織化學(xué)染色和Weil改良法髓鞘染色，觀察損傷區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)的修復(fù)。 結(jié)果：倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察結(jié)果顯示：NSCs克隆球充滿PLGA支架孔隙，其形狀近似孔隙的不規(guī)則幾何形狀；誘導(dǎo)分化后，大量NSCs長出的神經(jīng)突觸跨越支架孔隙的三維微觀結(jié)構(gòu)，布滿支架的表面和孔隙，并彼此建立了突觸聯(lián)系。誘導(dǎo)分化前后免疫組織化學(xué)鑒定分別為巢蛋白和微管相關(guān)蛋白2抗體陽性，說明誘導(dǎo)分化前是NSCs，誘導(dǎo)分化后有神經(jīng)

4、元形成。BBB評(píng)分結(jié)果顯示：傷后2～12w實(shí)驗(yàn)組的BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分均較各對(duì)照組明顯提高(P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)B組又高于實(shí)驗(yàn)A組(P<0.05)，對(duì)照C組和對(duì)照D組評(píng)分無顯著差異(P>0.05)，對(duì)照E組評(píng)分最低(P<0.05)。HRP神經(jīng)逆行示蹤顯示：兩實(shí)驗(yàn)組腦組織中均可見到較多的HRP標(biāo)記陽性神經(jīng)元，且實(shí)驗(yàn)B組又多于實(shí)驗(yàn)A組，而對(duì)照C組和對(duì)照D組僅見少量HRP陽性神經(jīng)元，對(duì)照E組沒有見到HRP陽性神經(jīng)元。免疫組織化學(xué)染色和Weil

5、改良法髓鞘染色顯示：兩實(shí)驗(yàn)組移植區(qū)NF陽性神經(jīng)元和GAP-43陽性神經(jīng)軸索數(shù)量較多，而對(duì)照C組和對(duì)照D組極少，對(duì)照E組沒有發(fā)現(xiàn)陽性神經(jīng)元和神經(jīng)軸索；兩實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)軸索和髓鞘的再生較明顯，且實(shí)驗(yàn)B組的形態(tài)結(jié)構(gòu)修復(fù)優(yōu)于實(shí)驗(yàn)A組，而對(duì)照C組和對(duì)照D組神經(jīng)軸索和髓鞘的再生不明顯，仍留下不同程度的缺損，對(duì)照E組未見神經(jīng)軸索和髓鞘的再生，留下巨大缺損。 結(jié)論：PLGA支架支持NSCs的生長和分化，其微觀結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)并規(guī)范了NSCs生長和遷移的方向