ALPL基因突變影響ADRB2基因調(diào)控BMMSCs成骨分化的實驗研究.pdf

1、低堿性磷酸酯酶癥(Hypophosphatasia,HPP)是一種由 ALPL基因突變引起的遺傳性系統(tǒng)性疾病,因其編碼的非組織特異性堿性磷酸酶(Tissue nonspecific alkaline phosphatase,TNAP)活性降低從而表現(xiàn)出骨骼及牙齒硬組織發(fā)育不良,以及血清堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性偏低。ALP的高表達是成骨細胞分化的特異性標志,對骨骼的發(fā)育起到關(guān)鍵作用。目前對HPP發(fā)

2、病機制的研究尚不深入。因此,探索由ALPL基因突變導致的細胞及分子學變化的機制對于深入理解HPP致病機理和提供新的治療思路具有重要的意義。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)在整個骨組織的發(fā)育、改建和骨折修復中發(fā)揮了非常重要的作用。因此,HPP患者來源的BMMSCs可以作為研究該疾病的最佳模型。本研究對3名HPP患兒進行臨床、實驗室檢查和遺傳學診斷,并觀察Akp2敲除小鼠

3、骨骼發(fā)育狀況,證明ALPL基因突變對骨骼發(fā)育的影響;進而對2名HPP患兒及正常同齡兒童的BMMSCs進行體外培養(yǎng)及生物學特性的檢測,明確 HPP患兒BMMSCs的異常表現(xiàn);利用表達譜芯片檢測,首次發(fā)現(xiàn)正常和 HPP患兒 BMMSCs中與成骨分化關(guān)系密切的差異基因 ADRB2;進一步通過對正常兒童及 HPP患兒BMMSCs進行ALPL基因表達調(diào)控,首次證明在BMMSCs成骨分化過程中ALPL對ADRB2具有負向調(diào)控作用;最后分別對正常兒童

4、及 HPP患兒 BMMSCs中 ADRB2進行基因表達調(diào)控,證實ADRB2對BMMSCs成骨分化的作用。本課題研究內(nèi)容分以下四部分:
　　第一部分 ALPL基因突變導致成骨發(fā)育不全的檢測
　　目的:明確 ALPL基因突變情況下骨組織的發(fā)育異常表現(xiàn)。材料與方法:對3名患兒進行臨床、實驗室檢查和遺傳學分析,做出明確診斷并證明HPP患兒的成骨發(fā)育不全表型;進而通過對 Akp2+/-小鼠骨組織結(jié)構(gòu)進行病理學觀察,明確 ALPL基因突

5、變情況下骨組織的發(fā)育異常表現(xiàn)。結(jié)果:3名患兒均表現(xiàn)為血清ALP活性降低,長骨的密度及強度不足,牙根發(fā)育不良以及牙齒過早脫落。遺傳學分析發(fā)現(xiàn)3名患兒均存在ALPL基因突變,由此可將3名患兒確診為兒童型低堿性磷酸酯酶癥;組織學觀察顯示,Akp2+/-小鼠骨骼發(fā)育上存在缺陷,脛骨結(jié)構(gòu)異常。結(jié)論:3名患兒均為兒童型低堿性磷酸酯酶癥,均存在骨組織發(fā)育不全表型,而 Akp2+/-小鼠也存在骨發(fā)育異常,從而證明ALPL基因突變可導致骨骼發(fā)育異常。

6、r>　　第二部分 HPP患兒BMMSCs的生物學特性研究
　　目的:探索HPP患兒BMMSCs的異常生物學行為與基因表達,為HPP的致病機制提供分子水平證據(jù)。材料與方法:對2名 HPP患兒及正常同齡兒童 BMMSCs進行分離培養(yǎng)及鑒定,并對其進行生物學特性的檢測;利用全基因組表達譜芯片檢測正常和HPP患兒BMMSCs成骨誘導分化前后的基因表達情況,篩選正常和HPP患兒BMMSCs成骨分化相關(guān)的差異基因。結(jié)果:體外培養(yǎng)獲得的2名HP

7、P患兒及正常同齡兒童BMMSCs均為間充質(zhì)來源的干細胞,均具有多向分化能力,HPP患兒來源BMMSCs增殖能力與成骨分化能力較正常同齡兒童顯著降低;通過全基因組芯片的篩選與驗證,發(fā)現(xiàn)ADRB2基因表達在正常和HPP患兒BMMSCs成骨分化中存在顯著差異。結(jié)論:ALPL基因突變可導致BMMSCs成骨分化能力減弱,并且在ALPL突變的情況下,ADRB2基因在成骨過程中的表達發(fā)生顯著改變。
　　第三部分 BMMSCs成骨分化中ALPL對

8、ADRB2影響的實驗研究
　　目的:證明ALPL基因?qū)MMSCs成骨分化能力及ADRB2基因表達的影響。材料與方法:分別對正常兒童及HPP患兒BMMSCs的ALPL基因進行沉默/過表達,并對調(diào)控后的細胞進行成骨分化能力和ADRB2基因的表達情況進行檢測。結(jié)果:干擾正常兒童BMMSCs中ALPL基因表達后,細胞的成骨能力顯著下降,且在成骨過程中,ADRB2的變化程度也減弱;過表達HPP患兒BMMSCs的ALPL基因可以改善患者細胞

9、的成骨能力,并且在成骨過程中對 ADRB2起到下調(diào)作用。結(jié)論:ALPL基因?qū)MMSCs成骨分化具有促進作用,而對ADRB2的表達具有負向調(diào)控能力。
　　第四部分 ADRB2在BMMSCs成骨分化中的作用研究
　　目的:證明ADRB2在BMMSCs成骨分化中的作用。材料與方法:首先將HPP患兒的BMMSCs進行ADRB2基因沉默,并對細胞成骨能力進行檢測;進而將正常兒童BMMSCs進行ADRB2基因過表達,同樣檢測細胞成骨能