強精片對不育大鼠生精微環(huán)境及睪丸BTB影響的實驗研究.pdf

1、目的：生精微環(huán)境是血-睪屏障內(nèi)各種生殖細胞（支持細胞、生精干細胞、各級生精細胞和精子）以及各種調(diào)節(jié)因子共同構(gòu)成的一個相對封閉的細胞外環(huán)境，直接參與生精過程的調(diào)節(jié)，為精子發(fā)生的必要基礎。閉鎖蛋白（Occludin）是睪丸內(nèi)緊密連接（tight junction）的主要蛋白之一，參與構(gòu)建TJ和血-睪屏障（blood-testis barrier，BTB），后者為生精微環(huán)境的存在提供了的物質(zhì)基礎。目前已正式occludin能夠調(diào)節(jié) TJ電阻，

2、干擾 BTB，阻斷精子發(fā)生。Cx43屬膜蛋白家族，參與構(gòu)建了縫隙連接介導的細胞間通信(gap junctional intercellular communication，GJIC)。目前證實Cx43為睪丸內(nèi)含量最豐富的連接蛋白，大量分布于支持細胞、間質(zhì)細胞以及支持細胞與生殖細胞的連接處，協(xié)調(diào)生殖細胞間功能，調(diào)控生精微環(huán)境，維持精子的發(fā)生。院內(nèi)制劑“強精片”的前期研究已證實該藥能夠改善不育患者精液指標，并能提高附睪內(nèi)多種活性物質(zhì)含量，但

3、對睪丸生精微環(huán)境內(nèi)BTB及細胞間相互作用的影響仍是空白。因此本課題在“腎主生殖”理論指導下，旨在探討基于生精微環(huán)境中多種蛋白分子改變下中藥制劑強精片對不育大鼠的生殖保護作用，以期從微觀找到強精片改善精子狀態(tài)的新的分子基礎，為中藥治療不育提供實驗依據(jù)。
　　方法：將70只健康雄性SD大鼠隨機分為空白組20只與造模組50只，造模組采用雷公藤多甙灌胃法復制大鼠不育模型，空白組給予等計量羧基纖維素鈉灌胃。大鼠造模灌胃后第3w，隨機選取正常

4、組和模型組大鼠各10只，殺檢取材檢驗造模是否成功。剩余40只模型大鼠隨機分為四組，即模型對照組、強精片低劑量組、強精片中劑量組、強精片高劑量組。其中中藥干預各組藥物用量分別按正常人用量的5倍、9倍、20倍計算，并給予相應劑量的雷公藤多甙，模型組GTW灌胃，空白組給予羧基纖維素鈉，五組大鼠灌胃4w，每日1次，每周稱重調(diào)整用藥劑量，于末次灌胃2h后腹主動脈取血處死，分離睪丸、附睪、精囊與前列腺進行相關(guān)指標檢測。
　　結(jié)果：⑴血清性激素

5、水平測定顯示，模型組與空白組相比，大鼠血清FSH值、LH值組間差異性無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而血清睪酮T水平降低顯著(P<0.01)；與模型組相比，中藥干預各組血清睪酮 T值均有提高，且以高劑量組最為顯著（P<0.01）；而中藥各組對大鼠血清FSH、LH值的改善均不明顯（P＞0.05）；但強精片高劑量組較中、低劑量組LH有下降趨勢；取附睪精液檢測指標顯示，灌胃3w后，模型對照組精子密度下降、精子活力下降，精子活率減低，與空白對照組

6、比較有極顯著差異(P<0.01)。說明模型大鼠睪丸內(nèi)存在生精障礙，實驗造模成功。中藥干預后，各劑量中藥組在精子密度、精子活力及活率方面均有大幅度提高(P<0.01)，并顯示出一定量效關(guān)系趨勢。⑵稱重性腺及其附屬器官質(zhì)量計算結(jié)果顯示：強精片能夠增加睪丸與附睪質(zhì)量(P<0.05)，其中附睪更為明顯(P<0.01)，但對精囊、前列腺無顯著作用。HE染色病理形態(tài)學觀察結(jié)果：GTW模型大鼠睪丸內(nèi)生精小管管徑大小不一，部分管腔堵塞或坍塌，管壁菲薄，

7、生殖細胞減少，細胞間隙增大，管腔內(nèi)可見脫落細胞，成熟精子消失，局灶性精子管壞死，間質(zhì)水腫。中藥干預后能有效緩解局部生殖細胞的壞死，有效減輕GTW睪丸病理形態(tài)學改變，部分恢復組織的生精功能。⑶分別應用免疫組化和Western Blot法測定ABP和FasL在不育SD大鼠睪丸組織中的表達，與空白組相比，模型組FasL及ABP表達量明顯升高（P<0.01），應用中藥強精片干預4w后，各治療組睪丸組織ABP及FasL表達均有所下降，其中高劑量組

8、ABP和FasL蛋白表達顯著高于模型組（P<0.01或P<0.05）。⑷Western Blot半定性檢測睪丸組織內(nèi)OCLN及Cx43蛋白表達量，免疫組化法觀察OCLN蛋白在睪丸組織中的表達與分布。結(jié)果顯示模型組較空白組OCLN及Cx43蛋白表達量均有降低（P<0.01或P<0.05），給予中藥干預4w后，中藥各劑量組OCLN蛋白的表達量均有顯著提高（P<0.05），但Cx43蛋白僅在中劑量和高劑量組中較為明顯，其中中劑量組改善值具有統(tǒng)

9、計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：①雷公藤多甙可能通過上調(diào) Fas/FasL信號通路，誘導生精細胞凋亡，同時對OCLN蛋白的表達進行抑制，增加BTB通透性，破壞生精微環(huán)境，最終導致精子密度、活力、活率等指標降低，造成不育。并且雷公藤多甙可能通過抑制Cx43蛋白表達影響SC和LC細胞功能，并干擾支持細胞調(diào)節(jié)生精細胞的過程，這可能是GTW致不育的原因之一。②中藥強精片可能通過下調(diào) Fas/FasL系統(tǒng)，達到保護生精功能的作用，且該