杧果ISSR標(biāo)記及其優(yōu)良單株的早期鑒定.pdf

1、杜果是世界五大熱帶水果之一，也是我國著名的熱帶水果。為了弄清我國杜果主栽品種及地方品種的親緣關(guān)系，探索早期快速鑒定優(yōu)良單株的方法。本論文選用一種簡便、快速、可靠的分子標(biāo)記——ISSR技術(shù)，探討其在杧果的親緣關(guān)系、遺傳多樣性、品種鑒定以及在豐亡果炭疽病和生理病害早期鑒定中的應(yīng)用。主要研究結(jié)果如下： 1、改良了杧果基因組DNA的提取方法，提取出的杜果基因組DNA質(zhì)量高，適合于ISSR擴(kuò)增；葉綠體DNA的提取是采用先提取葉綠體，再經(jīng)過

2、蔗糖梯度(70％．60％．45％．30％．)純化，然后采用CTAB法裂解葉綠體得到高純度的葉綠體DNA。 2、優(yōu)化了適于杧果屬植物ISSR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序：總體積20 μ L，10mmo l/L Tris-HCI(pH 8.3)，50mmoI/L KCI，1.5mmo I/L MgCI<,2>，0.2mmo I/L dNTP，0.25 μmoI/L primer，1 UгTaq poIymerase(TakaraBiot

3、echno Iogy，Japan)，60ng DNA。擴(kuò)增反應(yīng)的程序：94℃5min預(yù)變性：94、C 1min，47℃-53℃(葉綠體DNA是50℃-55℃)1min，72℃2min，40個循環(huán)：72℃延伸10 min。 3、從120條ISSR引物中篩選出20條條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物用于基因組DNA擴(kuò)增；從50條lSSR引物中篩選出8條適合于葉綠體DNA擴(kuò)增的引物，其中有7條是基因組DNA和葉綠體DNA共有的引物。

4、4、從30個引物中篩選出6個多態(tài)性好的ISSR引物建立DNA指紋圖譜用于區(qū)分呂宋杜品種(系)。分析DNA指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)這6個引物中每個引物都能區(qū)分呂宋系列品種(系)，呂宋杜和其它供試的7個品種(系)同源性低，而這7個品種(系)：高州呂宋杧、湛江呂宋杧、田陽香杧、金錢杧、柳州呂宋杧、粵西一號、攀西紅呂宋同源性較高，可歸為一類。表明lSSR—PCR技術(shù)對杧果品種(系)的鑒定非常有效，能區(qū)分親緣關(guān)系很近的品種(系)。 5、以38個杧果

5、栽培種、扁桃、冬杧為試材，并從42個lSSR引物中篩選出9個多態(tài)性好的引物進(jìn)行l(wèi)SSR-PeR研究，聚類分析發(fā)現(xiàn)所有供試的23個廣西地方品種與秋豐亡、馬切蘇杧、象牙杧和愛文杧歸為一個大類，而且廣西本地杧果品種之間的親緣關(guān)系較近。 6、對廣西農(nóng)科院果樹資源圃的33個杧果品種和2個近緣種扁桃、冬杧分別進(jìn)行基因組DNA和葉綠體DNA lSSR分析。選出多態(tài)性好的7個lSSR共有引物，用UP(3MA進(jìn)行聚類分析，若以0.73為相似系數(shù)分

6、界點(diǎn)，葉綠體DNA ISSR把35個樣品分為四類，而基因組DNA-lSSR將35個樣品歸為二類。雖然葉綠體DNA ISSR比基因組DNA ISSR擴(kuò)增的條帶數(shù)少，但是它的多態(tài)性比率卻高于基因組ISSR(79.4％vs 70.7％)。在杧果親緣關(guān)系分析上，葉綠體DNA lSSR分析優(yōu)于基因組DNA ISSR分析。 7、利用ISSR技術(shù)鑒別柁果生理病害。從42條ISSR引物中選用9條引物，對20個杜果樣品進(jìn)行ISSR-PCR研究，探

7、討其與果實(shí)生理病害關(guān)系。結(jié)果表明：20個杧果品種聚類為兩組，8個患果實(shí)生理病害的品種聚類為一組，12個不表現(xiàn)果實(shí)生理病害的品種聚類為另一組。根據(jù)這一結(jié)果，可利用這9條引物對杜果品種是否易患生理病害進(jìn)行早期初步鑒定。 8、利用I SSR技術(shù)鑒別杧果炭疽病。從120條ISSR引物中選用8個ISSR的引物，對臺農(nóng)一號、水英達(dá)、愛文、海頓等20個杧果品種進(jìn)行炭疽病抗病性分析，結(jié)果顯示I SS--POR聚類關(guān)系與杧果炭疽病的抗性有很大的相