兔外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)制備的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 1.探討在皮膚損傷條件下,外周血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(PBMSCs)的分離培養(yǎng),并觀察其成骨及成軟骨細(xì)胞分化的潛能。從而建立一種兔外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法,為將外周血來(lái)源的MSCs作為組織工程種子細(xì)胞奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 2.使用化學(xué)消化法脫除同種異體肋軟骨組織內(nèi)細(xì)胞成分,形成脫細(xì)胞基質(zhì)。同時(shí)采用自體外周血MSCs體外誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化作為種子細(xì)胞,與同種異體軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)共同培養(yǎng),觀察誘導(dǎo)的MSCs在

2、脫細(xì)胞基質(zhì)上的生長(zhǎng)情況,以期尋找到組織工程化軟骨構(gòu)建所需的理想種子細(xì)胞和生物支架材料。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用新西蘭大白兔建立皮膚創(chuàng)傷模型,抽取創(chuàng)傷前后兔股靜脈血,用密度梯度離心法分離純化單個(gè)核細(xì)胞。
　　 2.分別應(yīng)用α-MEM培養(yǎng)基和LG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,觀察外周血MSCs的生長(zhǎng)情況,并用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,比較不同培養(yǎng)基對(duì)外周血MSCs培養(yǎng)效果的影響。。
　　 3.誘導(dǎo)MSCs向

3、成骨細(xì)胞分化:取P2代細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組用成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)MSCs定向分化,對(duì)照組用含10％胎牛血清的α-MEM常規(guī)培養(yǎng)液自然分化,觀察細(xì)胞形態(tài),并分別進(jìn)行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色,以檢測(cè)堿性磷酸酶及鈣化結(jié)節(jié)的形成。
　　 4.誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化:取P2代細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組用軟骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)MSCs定向分化,對(duì)照組用1096胎牛血清的α-MEM常規(guī)培養(yǎng)液自然分化,觀察細(xì)胞形態(tài),免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)Ⅱ型膠原的表達(dá)。
　　 5.

4、另取新西蘭大白兔處死后立即切取肋軟骨,以無(wú)菌PBS沖洗后,順序浸入1％Triton X-100和DNAse、RNAse溶液內(nèi)振蕩消化。其中以1％Trixton消化時(shí)間長(zhǎng)短分為24小時(shí)組、48小時(shí)組、72小時(shí)組和96小時(shí)組。分別采用組織切片HE染色、掃描電鏡等方法觀察樣本脫細(xì)胞效果并比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)創(chuàng)傷刺激后所獲得的兔外周血MSCs數(shù)量明顯增加。
　　 2.細(xì)胞形態(tài)觀察:原代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞呈圓

5、形、梭形、多角形,傳代純化后呈均一的長(zhǎng)梭形。其生長(zhǎng)曲線均呈典型的“S”形。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn),原代細(xì)胞在α-MEM中12h即可貼壁,48h后匯合,5天左右形成分布均勻的細(xì)胞集落,7～8天集落逐漸增大,相鄰集落融合成片狀;細(xì)胞貼壁及匯合時(shí)間要早于LG-DMEM組,且前者形成的集落數(shù)也要高于后者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明α-MEM較L-DMEM更有利于外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 3.成骨誘導(dǎo):實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞可呈多角形、梭形或三角形,有大

6、小不一、長(zhǎng)短不均的突起,胞漿內(nèi)可見(jiàn)較大顆粒,胞核呈卵圓形,可見(jiàn)細(xì)胞分裂相和2-3個(gè)核仁,其增殖速度較緩慢;對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)基本為長(zhǎng)梭形,增殖旺盛。實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶染色顯示PBMSCs胞漿中可見(jiàn)淺棕色至棕黑色的細(xì)小顆粒,說(shuō)明堿性磷酸酶的存在。誘導(dǎo)后的PBMSCs形成的鈣結(jié)節(jié)經(jīng)茜素紅染色后,呈明顯陽(yáng)性(為紅色結(jié)節(jié))。對(duì)照組為陰性反應(yīng)。
　　 4.成軟骨誘導(dǎo):實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速度低于對(duì)照組,形態(tài)逐漸有長(zhǎng)梭形向多角形、圓形轉(zhuǎn)化,隨著誘導(dǎo)時(shí)間

7、延長(zhǎng),出現(xiàn)聚集生長(zhǎng)的趨勢(shì);對(duì)照組細(xì)胞基本保持長(zhǎng)梭形,增殖能力旺盛。免疫組化結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組Ⅱ膠原表達(dá)逐漸增強(qiáng),培養(yǎng)兩周后實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)胞漿內(nèi)黃色或棕黃色顆粒出現(xiàn),而對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞不明顯。
　　 5.使用1％Triton X-100溶液與酶聯(lián)合消化法制備兔同種異體肋軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)至少需要作用96小時(shí),方可完全脫除軟骨部分全部細(xì)胞成分。HE染色顯示96小時(shí)組肋軟骨樣本細(xì)胞成分完全脫失;掃描電鏡顯示脫細(xì)胞基質(zhì)軟骨細(xì)胞脫除徹底,可見(jiàn)軟骨基質(zhì)