骨髓間充質干細胞-脫細胞膀胱基質-聚丙烯復合網片的實驗研究.pdf

1、盆腔器官脫垂(pelvic floor prolapse,POP)是中老年婦女的常見病疾之一,中重度POP可以嚴重影響女性生活質量并造成巨大的心理負擔,臨床上亟需有效的治療方法。盆底重建手術是治療中重度 POP最重要的手術方式。傳統(tǒng)POP修復術式主要是在已經受損或有異常膠原生成的薄弱盆底組織(筋膜、結締組織及韌帶)上進行手術修補,無法從根本上解決組織缺陷的疾病本質,術后復發(fā)率高,因此臨床上亟需更為安全穩(wěn)定的修補材料(作為盆底薄弱組織的有

2、效替代)來改進手術方式,從而提高POP手術治療的效果。
　　近年來,生物組織工程技術發(fā)展十分迅速,生物工程組織替代材料作為薄弱或受損盆底的支持物可更好的用于盆底正常解剖結構的重建,達到恢復盆底正常支持功能的目的。聚丙烯網片(polypropylene mesh,PM)作為一種合成網片在盆底重建手術中應用較為廣泛,但易發(fā)生感染、攣縮、排異、慢性疼痛、性交困難等不良反應,嚴重影響患者術后的生活質量。細胞外基質(extracellula

3、r matrix,ECM)具有良好的組織相容性,在植入體內后可發(fā)揮免疫調節(jié)的作用,促進Th1細胞(免疫排斥)向Th2細胞(免疫耐受)及M1型巨噬細胞(促炎癥和細胞毒性)向M2型巨噬細胞(抗炎和組織修復)的轉變。豬脫細胞后的膀胱基質(urinary bladder matrix,UBM)屬于ECM的一種,來源便捷,生產成本較低,是目前生物材料研究范疇的熱點之一,其缺點是植入體內后降解較快。來源于骨髓的間充質干細胞(bone mesench

4、ymal stem cells,BMSCs)屬于多能干細胞的一種,來源豐富且具有多向分化潛能,是組織工程常用的種子細胞之一。BMSCs作為一種修復干細胞,在一定的生物微環(huán)境中可分化為具有與周圍組織相似的功能細胞,參與到受損部位的組織修復。同時,BMSCs在體內外表現(xiàn)出顯著的抗炎癥和免疫抑制的作用。本研究采用聯(lián)合物理與化學的方法制備豬脫細胞UBM,并采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs,利用組織工程學的原理將培養(yǎng)的BMSCs接種于UB

5、M-PM支架上,構建了BMSCs-UBM-PM復合網片。同時,觀察BMSCs-UBM-PM植入大鼠腹部皮下后引起的組織病理學變化、炎癥反應、免疫耐受情況,并行力學性能檢測,探討其用作盆底修復和重建候選替代材料的可行性。
　　一、實驗方法
　　1、豬脫細胞UBM的制備
　　本研究對豬膀胱采用去污劑洗滌、攪拌、酶消化法進行脫細胞處理,制備UBM。掃描電鏡觀察凍干UBM形態(tài)。取UBM標本常規(guī)石蠟切片后行HE及DAPI染色觀察

6、脫細胞效果,堿水解法測定UBM標本中羥脯氨酸的含量,分子生物學方法測定UBM標本中的DNA濃度。
　　2、大鼠BMSCs的分離、鑒定其在UBM上的生長及增殖研究
　　采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠 BMSCs,腺病毒(攜帶有 GFP基因片段)感染SD大鼠BMSCs。流式細胞儀檢測細胞表面分子CD29、 CD44、CD31、CD45,成脂、成骨、成軟骨誘導試劑盒檢測BMSCs向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞分化。CCK-8細胞增

7、殖實驗、掃描電鏡觀察BMSCs在UBM上的生長、增殖情況。
　　3、骨髓間充質干細胞-脫細胞膀胱基質-聚丙烯復合網片在大鼠體內的實驗研究
　　SD大鼠隨機分為4組,每組20只,根據(jù)預植入材料的不同,分別命名為BMSCs-UBM-PM組(PM夾于負載有BMSCs的雙層UBM之間)、UBM-PM組(PM夾于未負載BMSCs的雙層UBM之間)、PM組(單純PM)和假手術(sham-operated,S)組。手術后第1、2、4、6周

8、分批處死大鼠,取材行HE染色、Masson染色、免疫組化染色、免疫熒光染色和力學測試。
　　二、實驗結果
　　1.經脫細胞處理后的膀胱未見明顯的細胞成分殘留,可見均質狀態(tài)的基質和呈網絡樣結構改變膠原纖維。凍干后的 UBM干燥、質地堅韌,抗張力強度高,延展性下降。掃描電鏡下可見膠原纖維排列整齊、均勻,紋理較粗,呈條索狀改變。脫細胞前UBM中的平均羥脯氨酸含量為2.45μg/mg,脫細胞后UBM中的平均羥脯氨酸含量為2.34μg

9、/mg,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。UBM中的平均DNA濃度由脫細胞前的443.71μg/ml降為脫細胞后的4.32μg/ml,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　2.全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng) SD大鼠 BMSCs,24h觀察發(fā)現(xiàn)細胞部分貼壁,48h觀察發(fā)現(xiàn)貼壁細胞分裂增殖,呈梭形或多邊形,細胞傳代3次形態(tài)上無較大改變。BMSCs表達CD29的陽性率為98.74％、CD44的陽性率為95.43%、CD31的陽性率為2.03

10、%、CD45的陽性率為1.14%。成脂、成骨、成軟骨誘導BMSCs后油紅 O、茜素紅及阿利新藍染色均呈陽性,腺病毒(攜帶有GFP基因片段)能成功感染BMSCs。CCK-8細胞增殖實驗提示BMSCs在UBM上生長良好,增殖能力較強。掃描電鏡下見BMSCs在UBM上呈梭形或多邊形生長。
　　3.BMSCs-UBM-PM組炎癥細胞浸潤少且膠原纖維、新生血管較多。免疫熒光示BMSCs可在體內至少存活6周,部分可分化為平滑肌細胞。免疫組化結

11、果提示BMSCs-UBM-PM在各周的CXCR3(Th1細胞表面標志)陽性比例均低于其他各組,而PM在各周的CXCR3陽性比例均高于其他各組。UBM-PM的CXCR3陽性比例介于兩者之間。BMSCs-UBM-PM和UBM-PM的CCR4(Th2細胞表面標志)陽性比例在第2周達到最高,而PM的CCR4陽性比例在各周均處于較低水平。力學測試顯示, BMSCs-UBM-PM組最大負荷(kN)為0.31±0.08,最大張力(mm/mm)為0.6

12、2±0.19,楊氏模數(shù)(MPa)為43.36±11.83,均顯著高于其他組測試結果。
　　三、主要結論
　　1.聯(lián)合物理與化學的方法進行脫細胞處理,制備的 UBM有良好的組織相容性,膠原蛋白丟失較少,消毒、凍干后易于儲存,是一種較為理想的組織工程、盆底修復和替代用生物支架材料。
　　2.全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)所得的 SD大鼠 BMSCs純度高,活性好,體外擴增能力強,可作為組織工程用的種子細胞。
　　3. BMS