海洋瓊膠降解細(xì)菌的多樣性研究與Agarivorans albus QM38 β-瓊膠酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、對(duì)青島近海海水中瓊膠降解細(xì)菌進(jìn)行了系統(tǒng)的分離，篩選得到87株海洋瓊膠降解細(xì)菌。從中選出15株有代表性的菌株，克隆其16SrDNA序列，進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果表明，這些細(xì)菌主要分布在Cellulophaga，Cytophaga，Microbulbifer，Glaciecola，Pseudoalteromonas，Pseudomonas，Alteromonas和Agarivorans共8個(gè)屬中。其中QM5，QM21，QM36鑒定為Cellulo

2、phaga lytica，QMl5和QM28鑒定為Glaciecola mesophila，QM11，QM35，QM47，QM65分別鑒定為Cytophaga fucicola，Pseudoalteromonas atlantica，Pseudoalteromonas haloplanktis，Alteromonas addita。其余5株菌能夠鑒定到屬的水平。 對(duì)細(xì)菌QM42和DH166的鑒定結(jié)果表明，這兩株細(xì)菌都是革蘭氏陰性

3、的桿狀細(xì)菌，生長(zhǎng)需要NaCl，說(shuō)明它們都是海洋細(xì)菌。QM42細(xì)胞寬度為0．6-0．7μm，長(zhǎng)度為1．5-2．5μm，不產(chǎn)生芽孢。它能夠產(chǎn)生氨肽酶、氧化酶和接觸酶，并且能夠利用下列糖類產(chǎn)酸：葡萄糖、木糖、乳糖和纖維二糖。細(xì)菌DH166是從東海中部海區(qū)50米深度的水樣中分離到的一株海洋細(xì)菌。其生長(zhǎng)對(duì)于營(yíng)養(yǎng)條件的要求比較苛刻，培養(yǎng)基中沒(méi)有豐富的有機(jī)物，它不能夠生長(zhǎng)。在1％和6％的NaCl含量的條件下都不能生長(zhǎng)。對(duì)這兩株細(xì)菌進(jìn)行了脂肪酸分析和1

4、6SrDNA序列分析。初步鑒定QM42屬于一個(gè)潛在的新種，而且可能是一個(gè)新屬，與Marinobacter，Microbulblyer和Alcanivorax等屬相近。細(xì)菌DH166屬于Pseudoalteromonas屬的一個(gè)潛在的新種。 對(duì)細(xì)菌QM38進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。通過(guò)形態(tài)觀察，生理生化特征鑒定以及16SrDNA序列分析，鑒定細(xì)菌QM38為Agarivorans albus。初步研究了細(xì)菌QM38瓊膠酶搖瓶發(fā)酵的條件，對(duì)

5、其產(chǎn)生的瓊膠酶粗酶液進(jìn)行了分析，研究了底物濃度和pH對(duì)酶活力的影響并分析了其酶解產(chǎn)物。 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的其他細(xì)菌的瓊膠酶的基因序列設(shè)計(jì)引物，從Agarivorans albus QM38的基因組DNA中克隆得到了三條編碼瓊膠酶的基因agaD01、agaD02和agaD03，并進(jìn)行了測(cè)序。其中兩條基因，agaD02和agaD03在Agarivorans屬的細(xì)菌中是首次被克隆和測(cè)序。agaD01和agaD02在GenBank中的收錄號(hào)

6、分別為EF051475和EF199908。序列分析的結(jié)果表明，在GertBznk數(shù)據(jù)庫(kù)中，共有三條序列與agaD01有相似性，分別是來(lái)自弧菌JT0107編碼β-瓊膠酶的agaA基因，序列號(hào)為D14721，相似性有97.8％；Agarivorans sp.JA-1編碼β-瓊膠酶的基因，序列號(hào)為EF100136，相似性有98.9％；Agarivorans sp.JAMB-A11編碼瓊膠酶agaA11的基因，序列號(hào)為EF100136，相似性有

7、98.2％。和其他序列則基本上沒(méi)有相似性。與agaD02有相似性的只有一條序列，就是弧菌JT0107編碼β-瓊膠酶的agaB基因，序列號(hào)為D21202。這兩條基因相似性有98.8％。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，只有兩條序列與agaD03有相似性，一條是弧菌PO-303編碼β-瓊膠酶agarase-c的基因，序列號(hào)為AB218419，這兩條基因相似性有96.8％。另外一條是Pseudoalteromonas sp.CY24編碼胞外瓊膠酶的基

8、因，序列號(hào)為AY293310，這兩條基因相似性有96.5％。但是agaD03和數(shù)據(jù)庫(kù)中的其他基因基本上沒(méi)有任何的同源性。對(duì)agaD01和agaD02編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，對(duì)這兩個(gè)蛋白及其同源蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的研究很少，如果能進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的研究，得到其催化特性，將能夠獲得許多新的數(shù)據(jù)與材料。 設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增細(xì)菌QM38的agaD02基因，產(chǎn)物克隆到載體pMD19-T。Simple，經(jīng)過(guò)酶切及

9、測(cè)序驗(yàn)證后，將此基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET24a，構(gòu)建表達(dá)載體pET24a-agaD02，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證。利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后的菌落進(jìn)行碘液染色，發(fā)現(xiàn)有透明區(qū)域，證明表達(dá)成功而且有瓊膠酶分泌到細(xì)胞外。 利用硫酸銨沉淀、分子篩層析和離子交換層析等方法，從Agarivorans albusQM38的培養(yǎng)液上清中分離純化出一個(gè)瓊膠酶組分。經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示為單一條帶，測(cè)定其