三株海洋新菌的鑒定及細(xì)菌017T和TS1T的瓊膠酶研究.pdf

1、海洋沉積物中蘊(yùn)藏著非常豐富的微生物資源，富集培養(yǎng)法可有效地分離獲得海洋新型菌株及特殊功能菌株，深入研究海洋功能微生物對(duì)于開發(fā)利用海洋資源有著重要的意義。本論文完成了三株海洋新菌的鑒定，一株瓊膠降解細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化，兩株瓊膠降解細(xì)菌的基因組生物信息學(xué)分析，并對(duì)6條瓊膠酶基因進(jìn)行了外源表達(dá)與產(chǎn)物分析，重組瓊膠酶Aga2293的純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究。
　　已完成三株海洋新菌的鑒定工作，確定菌株FB208T為擬桿菌門、擬桿菌綱、海洋

2、滑動(dòng)菌科、海絲菌屬的一個(gè)新種，命名為微白黃海絲菌，學(xué)名為Marinifilumalbidiflavum sp.nov.;確定菌株HF401T為擬桿菌門、擬桿菌綱、海洋滑動(dòng)菌科、海線菌屬的一個(gè)新種，命名為桶色海洋線狀菌，學(xué)名為Geofilum rhodophaea sp.nov.;確定菌株TS1T為變形菌門，γ變形菌綱的一個(gè)新屬新種，學(xué)名為Agarimarinamarina gen.nov.，sp.noV.。建議組建新的科級(jí)分類單位，海生

3、瓊膠菌科(Agarimarinaceae、)。
　　通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的海洋瓊膠降解細(xì)菌Agarilytica rhodophytacola017T進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化。確定了其最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件:瓊脂粉含量1.5 g/L，鹽度29.6 g/L，溫度33.17℃，胰蛋白胨6g/L，裝瓶量50 mL，接種量為2％，起始pH為6.5，搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm/min，培養(yǎng)時(shí)間36 h。在上述條件下，發(fā)酵液的

4、酶活為2.46 U/mL。
　　分別對(duì)海洋瓊膠降解細(xì)菌TS1T和017T進(jìn)行了基因組測(cè)序:細(xì)菌TS1T的基因組不含有質(zhì)粒，預(yù)測(cè)含有12條瓊膠酶基因，存在染色體DNA;細(xì)菌017T除了染色體DNA外，還含有4個(gè)質(zhì)粒，19條瓊膠酶基因存在于染色體DNA中，3條存在于1號(hào)質(zhì)粒上。對(duì)菌株TS1T和017T的6條呵能編碼瓊膠酶的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)aga1766、aga2293、aga2578、aga1620、aga2943、aga

5、3830分別屬于糖苷水解酶GH96、GH16、GH39、GH96、GH16、GH50家族。并對(duì)6條基因進(jìn)行了外源重組表達(dá)，除aga1766和aga2578外源表達(dá)無(wú)活性外，其它4條基因外源表達(dá)均有活性，并將外源表達(dá)產(chǎn)物分別命名為重組瓊膠酶Aga2293、Aga1620、Aga2943、Aga3830。通過(guò)薄層層析法發(fā)現(xiàn)重組瓊膠酶Aga2293、Aga1620、Aga3830的瓊脂糖水解產(chǎn)物為新瓊四糖和新瓊六糖，Aga2943的水解產(chǎn)物為

6、新瓊二糖和新瓊四糖。結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，初步確定基因aga2293、aga1620、aga3830為新的瓊膠酶基因。
　　使用鎳柱親和層析和梯度透析的方法對(duì)酶活最高的重組瓊膠酶Aga2293進(jìn)行了純化和復(fù)性，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度后，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。發(fā)現(xiàn)重組瓊膠酶Aga2293的最適底物濃度為2％，最適反應(yīng)溫度為40℃，≤45℃時(shí)酶活較穩(wěn)定，最適pH7，Cu2+對(duì)酶活有極大的抑制作用，Pb2+、Zn2+、C