BCL-2,NF-КB,血管緊張素ΙΙ-Ι受體在大鼠非酒精性脂肪肝病中的作用及其機制研究.pdf

1、 目的：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)近年來發(fā)病率逐年增高,是一種嚴(yán)重威脅著人類健康的常見疾病,是在患者無過量飲酒史的情況下,發(fā)生的與酒精性肝病(ALD)相似的肝臟病理學(xué)變化,其病理生理改變主要是肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死和凋亡,病程逐漸向脂肪性肝炎、肝纖維化,肝硬化發(fā)展?，F(xiàn)有研究認(rèn)為非酒精性肝病,是一種與遺傳基因易感性以及胰島素抵抗密切相關(guān)的應(yīng)激性代謝性肝損傷。本研究通過建立非酒精性脂肪性肝病大鼠模型,隨著其病變進展在不同時間點觀察肝細(xì)

2、胞凋亡,炎癥,纖維化,以及相關(guān)的蛋白BCL-2、NF-KB、血管緊素Ⅱ-1 受體的表達(dá)情況,從而探討以上三種相關(guān)蛋白在非酒精性肝病中的作用及其機制,并研究通過抑制NF-KB表達(dá)后,所致的肝臟病理形態(tài)變化及 BCL-2,血管緊素ΙΙ-1 受體的表達(dá)改變情況,為研究NAFLD發(fā)病機制及治療方案提供新的研究佐證。方法：健康成年雄性 Spague-Dawlay(SD)大鼠42只按隨機表為三組3組：正常組18只(普通飼料喂養(yǎng)),模型組18只(高脂

3、飲食喂養(yǎng)),干預(yù)組6只(高脂飲食飼養(yǎng)10周后PDTC腹腔注射4周),分別于6,10,14周末處死各組大鼠6只,每組大鼠處死后以心臟采血,并測定各組大鼠血脂和轉(zhuǎn)氨酶值,取肝組織標(biāo)本測定肝指數(shù)(處死大鼠開腹后迅速取出肝臟,稱肝濕重,(計算方法：肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%),固定并切片后蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肝組織病理改變(脂肪變,炎癥,纖維化等)；采用 TUNEL 法測肝細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)法測肝細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)；免疫組織化學(xué)法檢測Bcl-2

4、,NF-KB在肝組織中表達(dá)情況；RT-PCR法(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)檢測肝臟血管緊張素二-1受體(AT1R)的表達(dá)。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±S)表示,P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。不同時間段正常組與模型組組間比較,模型組與正常組組間比較,14 周干預(yù)組,模型組,正常組三組比較采用方差分析,并進行方差齊性檢驗,齊者采用單因素方差分析。結(jié)果：進行實驗的42只大鼠全

5、部存活,都進入結(jié)果進行分析。⑴隨著時間的延長,6 周末及 10 周末均成功構(gòu)建非酒精性脂肪肝及非酒精性肝炎模型,14 周末模型組出現(xiàn) 4 只大鼠肝纖維化,干預(yù)組出現(xiàn) 1只大鼠纖維化。(2)6、10、14周模型組大鼠在肝濕變數(shù)、血脂、血清轉(zhuǎn)氨酶水平等方面逐步增高,肝組織脂肪變、炎癥程度逐漸加重,后期出現(xiàn)纖維化表現(xiàn)；而干預(yù)組在上述方面亦有增高。(3)HE染色提示模型組6、10、14周動物肝組織出現(xiàn)脂肪變性并隨造模時間的延長而加重,都明顯高于

6、正常組(P<0.01)；10組大鼠肝臟可見少許氣球樣肝細(xì)胞及程度不等的肝細(xì)胞壞死和小葉內(nèi)炎癥、腺泡內(nèi)散在個別點灶狀壞死,部分可見點灶狀壞死增多,門管區(qū)輕中度炎癥。模型組6,10周大鼠未見肝組織纖維化,但造模14周及干預(yù)組14周分別有4/6、1/6只大鼠出現(xiàn)肝細(xì)胞竇周纖維化。6,10,14周模型組大鼠的肝臟活動度積分均高于正常組(P<0.01),14周末時,干預(yù)組肝組織的活動度積分低于模型組(P<0.05)。(4)肝細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)隨著造模

7、時間的延長而增加,模型組6周、10周、14周分別為11.15±0.82、16.19±1.23、19.23 ±2.31,正常組6周、10周、14周分別為1.11±0.15、1.26±0.11、1.15±0.20,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；⑷蛋白免疫組化顯示：BCL-2蛋白在模型組的細(xì)胞漿,細(xì)胞膜呈棕色表達(dá),并隨著造模時間的延長,染色程度加深,面積增大；Bcl-2 在正常組的表達(dá)均為散在弱陽性,模型組組6、10、14周陽性細(xì)胞數(shù)

8、漸增加,干預(yù)組Bcl-2表達(dá)低于 14 周模型組(P<0.05),NF-КB 細(xì)胞染色呈黃色或綜黃色為陽性,定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核,模型組6、10、14周大鼠肝細(xì)胞內(nèi)可見 NF-КB明顯活化,相對于同時間段正常組表達(dá)之間差別有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而且隨造模時間延長,其表達(dá)隨之增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),14 周干預(yù)組表達(dá)受較 14 周造模組受到抑制,但是較正常組比較其表達(dá)也是明顯增高的(P<0.05)。(5)

9、RT-PCR法檢測肝臟 AT1RmRNA 顯示：AT1RmRNA 表達(dá)量在造模組中隨著造模時間的延長,表達(dá)量逐漸增加,且每兩組模型組組間都存在統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)造模組AT1RmRNA表達(dá)量均明顯高于同時間段正常組(p<0.01),14周末,模型組,正常組,干預(yù)組三組間AT1RmRNA表達(dá)量存在差異(p<0.05)。結(jié)論：1.在非酒精性脂肪性肝病大鼠模型中,隨著肝臟病變的加重,其細(xì)胞凋亡,炎癥及纖維化愈加明顯,其表現(xiàn)為Bcl-2,