兩株DENV-2 E基因1-476序列原核表達產(chǎn)物對HUVEC通透性的影響.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建DENV-2 M株和NGC株E基因部分序列原核表達質(zhì)粒，進行蛋白表達、鑒定和純化，接種HUVEC細胞，并制備多克隆抗體。研究兩株DENV-2 E基因部分序列原核蛋白的表達及其對HUVEC通透性的影響。
　　方法:
　　將DENV-2 M株和NGC株E基因部分序列克隆入原核表達載體pET28a(+)，分別命名為pET28a(+)-M和pET28a(+)-N，經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21

2、(DE3)菌株，IPTG誘導(dǎo)表達、SDS-PAGE、Western-blot鑒定、純化表達產(chǎn)物;將蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后切膠研磨制成抗原，免疫BALB/c小鼠制備抗血清;并接種HUVEC單層細胞，全波長酶標(biāo)儀檢測通透性的改變，倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化，透射電鏡觀察細胞微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建了pET28a(+)-M和pET28a(+)-N原核表達重組質(zhì)粒，并誘導(dǎo)表達了重組蛋白，Western-b

3、lot表明該目的蛋白可與抗His標(biāo)簽單克隆抗體結(jié)合。
　　2.用Ni離子柱親和層析法進行純化獲得較高純度的原核蛋白，純度約90％。
　　3.制備了小鼠抗DENV-2 M株和NGC株E基因部分序列蛋白多克隆抗體。
　　4.將表達蛋白接種HUVEC單層細胞，全波長酶標(biāo)儀檢測通透性的改變，發(fā)現(xiàn)接種M蛋白后30min-24h及32h-48h對HUVEC通透性的影響較為明顯，12h時最明顯;而N蛋白對HUVEC的影響發(fā)生在30m

4、in-48h，3h最明顯;30min-10h及24h-36h時間段，N蛋白作用強于M蛋白;10h-24h及36h-48h內(nèi)，M蛋白作用強于N蛋白。
　　4.倒置顯微鏡觀察接種NGC株E蛋白3h時的細胞形態(tài)，可觀察到細胞間隙增寬程度較M株嚴(yán)重，多數(shù)細胞間連接斷裂，出現(xiàn)細胞皺縮。M株E蛋白接種12h時細胞間隙明顯增寬，細胞間連接斷裂，有細胞融合現(xiàn)象。
　　5.M株E蛋白接種12h時經(jīng)透射電鏡觀察可見HUVEC局部核膜間隙明顯增寬