BMSA菌毛島嶼PI-2a BP亞基基因抗原表位序列的克隆及原核表達(dá)產(chǎn)物抗原性研究.pdf

1、目的：在畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的內(nèi)蒙古通遼地區(qū)，奶牛乳腺炎不僅嚴(yán)重威脅著奶牛的健康，而且為乳制品的安全性帶來了潛在的風(fēng)險(xiǎn)。所以，研制出安全、高效的疫苗來防治奶牛乳腺炎迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)通過克隆奶牛乳腺炎無乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼骨架蛋白BP亞基基因，獲得其抗原表位基因編碼蛋白序列，經(jīng)構(gòu)建重組表達(dá)載體，使其在大腸桿菌中高效表達(dá)，并對(duì)表達(dá)蛋白的亞基抗原性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究奶牛乳腺炎無乳鏈球菌重組基因工程疫苗候選亞單位抗原提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　

2、方法：通過DNAMAN生物信息軟件分析Genbank中已有的無乳鏈球菌菌毛島嶼PI-2a的BP亞基抗原優(yōu)勢(shì)性表位基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)克隆引物，以通遼地區(qū)無乳鏈球菌臨床分離株總DNA為模板，克隆BP基因，測(cè)序后對(duì)其基因序列進(jìn)行分析與比對(duì)。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-BP，轉(zhuǎn)化至E.coli/BL21（DE3）中工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)Western-blot對(duì)進(jìn)行免疫反應(yīng)原性鑒定。利用Ni2+層析柱

3、對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行親和層析純化，經(jīng)弗氏佐劑處理定期免疫家兔，制備兔抗BP抗體，建立檢測(cè)免疫抗體滴度的間接ELISA方法。
　　結(jié)果：克隆測(cè)序結(jié)果顯示，成功克隆奶牛乳腺炎無乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼骨架蛋白BP基因，序列長609bp，共編碼203個(gè)氨基酸殘基。成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-30a(+)-BP，在大腸桿菌中獲得高效的可溶性原核表達(dá)，重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為33Ku，在裂解菌體的上清中可溶性蛋白表達(dá)量達(dá)到54.2％，純化