LIF-JAK1-STAT3信號(hào)通路延遲人角膜內(nèi)皮細(xì)胞接觸抑制作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究旨在探究人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在改良胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基體外培養(yǎng)中能持續(xù)增殖并延遲接觸抑制的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：通過(guò)比較人角膜內(nèi)皮單層細(xì)胞在SHEM，ESCM，ESCM+LIF，ESCM+bFGF和MESCM等不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)第7，21，35和42天后5-溴脫氧尿嘧啶核苷染色情況來(lái)判斷人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在不同環(huán)境下的增殖能力。并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)和定量分析胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物，神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)志物，骨形成蛋白配體和受體以及細(xì)胞周期相關(guān)基

2、因的表達(dá)情況。通過(guò)共聚焦熒光染色顯微鏡等技術(shù)觀察相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞不同部位的表達(dá)情況，從而明確人角膜內(nèi)皮細(xì)胞延遲接觸抑制的相關(guān)信號(hào)通路機(jī)制。
　　結(jié)果：人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在 SHEM培養(yǎng)基中第21天時(shí)5-溴脫氧尿嘧啶核苷染色陰性，而在ESCM+LIF和MESCM中第35天時(shí)仍染色陽(yáng)性。另外，在ESCM中添加白血病抑制因子（LIF，leukemia inhibitory factor）不僅和MESCM一樣可以明顯增加其中7種胚胎

3、干細(xì)胞和神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，還可以明顯增加Oct4，Rex1和SSEA4等胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。在ESCM中單獨(dú)或同時(shí)添加LIF和bFGF都不足以激活經(jīng)典或非經(jīng)典的BMP信號(hào)通路。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)磷酸化的STAT3核轉(zhuǎn)位只有在包含LIF的培養(yǎng)基中才存在，提示LIF激活了培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞中的LIF-JAK1-STAT3信號(hào)通路。第35天時(shí)通過(guò)JAK1和STAT3 siRNA的基因敲減技術(shù)處理可以消除人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在LIF包含的培養(yǎng)

4、基中陽(yáng)性的5-溴脫氧尿嘧啶核苷染色和G1/S細(xì)胞周期相關(guān)基因 p-Rb等的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)一步證實(shí)延遲人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的接觸抑制確實(shí)受LIF-JAK1-STAT3信號(hào)通路的調(diào)控。
　　結(jié)論：和SHEM相比，MESCM培養(yǎng)基可以通過(guò)延遲人角膜內(nèi)皮細(xì)胞接觸抑制的重建促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖生長(zhǎng)。其中LIF而不是bFGF可以激活LIF-JAK1-STAT3信號(hào)通路并通過(guò)促進(jìn) G1/S細(xì)胞周期正向基因的表達(dá)，從而達(dá)到延遲人角膜內(nèi)皮細(xì)胞接觸抑制的