CD81在星形膠質(zhì)細(xì)胞接觸抑制中的作用機(jī)制初探.pdf

1、接觸抑制現(xiàn)象具有重要的生理意義，其與機(jī)體內(nèi)器官、組織的形態(tài)、大小以及各類細(xì)胞數(shù)量的控制有著密切的關(guān)系。機(jī)體的組織器官生長(zhǎng)到一定程度后會(huì)自然停止生長(zhǎng)，而不是無(wú)限制的長(zhǎng)大；在體外培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞分裂增殖到一定程度，達(dá)到相互接觸時(shí)，細(xì)胞停止分裂。一般認(rèn)為，接觸抑制是由于細(xì)胞數(shù)量的增加消耗了局部區(qū)域的促分裂因子；另一方面是細(xì)胞接觸時(shí)自身分泌了一些細(xì)胞增殖的抑制因子。但Nakatsuji Y和HM.Robert的研究表明：星形膠質(zhì)細(xì)胞的接觸抑制

2、不是由可溶性因子所引起，而是由星形膠質(zhì)細(xì)胞間的相互接觸誘發(fā)了增殖抑制機(jī)制所引起的。目前接觸抑制的機(jī)制不甚清楚。為了研究接觸抑制的原理，我們以星形膠質(zhì)細(xì)胞做為模型細(xì)胞，研究了接觸抑制的可能機(jī)制，并探討了CD81在其中的可能作用。
　　 本研究共分三部分。第一部分為了觀察引起星形膠質(zhì)細(xì)胞接觸抑制的作用究竟是由于細(xì)胞自身分泌了一些細(xì)胞增殖的抑制因子，還是由于細(xì)胞相互接觸而引起的，本研究將純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞分三組，在細(xì)胞處于低匯合，半?yún)R

3、合，完全匯合時(shí)加入接觸抑制條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20h后，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)、以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相細(xì)胞指數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。條件培養(yǎng)基沒(méi)有抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，對(duì)其細(xì)胞周期也無(wú)明顯影響。結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞的接觸抑制不是由于星形膠質(zhì)細(xì)胞接觸時(shí)釋放的可溶性因子引起的，而是由星形膠質(zhì)細(xì)胞間的相互接觸誘發(fā)了增殖抑制機(jī)制所引起的。并進(jìn)一步觀察將處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細(xì)胞分離去接觸化，觀察細(xì)胞是否再次進(jìn)入增殖狀態(tài)，以及匯合后是否又進(jìn)入抑

4、制狀態(tài)。我們將處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細(xì)胞分離，再培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞將至低匯合、半?yún)R合和全匯合時(shí)加入BrdU，繼續(xù)培養(yǎng)6h后收集細(xì)胞，與結(jié)合有FITC的抗BrdU抗體共孵育，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞的BrdU陽(yáng)性率。結(jié)果顯示：處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細(xì)胞分離、再培養(yǎng)，細(xì)胞處于低匯合和半?yún)R合狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞增殖率再次增高。當(dāng)細(xì)胞全匯合處于接觸狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞增殖率明顯下降。表明：處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細(xì)胞分離去接觸后，細(xì)胞又恢復(fù)了增殖能力。而再

5、次相互接觸時(shí)，細(xì)胞增殖又受到抑制。
　　 CD81分子，即抗增生抗體識(shí)別的靶抗原(Target of the Antiproliferative Antibody-1，TAPA-1)，它是一種分子量為26KD的非糖基化膜蛋白,屬干四跨膜區(qū)蛋白（tetraspanin）超家族成員,含有4個(gè)跨膜轉(zhuǎn)膜區(qū)和2個(gè)胞外區(qū),廣泛分布在各種組織和細(xì)胞的表面,可影響細(xì)胞的粘附、激活、增殖和分化,有改變細(xì)胞形態(tài)、抑制合胞體形成等生物學(xué)功能。Sull

6、ivan等人研究發(fā)現(xiàn)未成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)CD81，隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞的逐漸成熟，CD81的表達(dá)也逐漸增強(qiáng)，逐步達(dá)到成年水平。CD81對(duì)細(xì)胞的增殖具有調(diào)節(jié)的作用，并且在不同的細(xì)胞發(fā)揮的作用不同。
　　 因此第二部分研究了抗CD81抗體對(duì)處于不同狀態(tài)的純化培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖抑制的影響。將純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞分三組，在細(xì)胞處于低匯合，半?yún)R合，完全匯合時(shí)加入抗CD81抗體（4μg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)后收集細(xì)胞，以MT

7、T比色法和流式細(xì)胞術(shù)觀察抗CD81抗體對(duì)處于不同狀態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明與對(duì)照組相比，抗CD81抗體對(duì)處于低匯合，半?yún)R合的星形膠質(zhì)細(xì)胞有明顯抑制作用，其抑制率分別為15.56%和34.44%，對(duì)處于完全匯合狀態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞有輕微抑制作用，其抑制率為9.62%。因此抗CD81抗體對(duì)處于低匯合和半?yún)R合的星形膠質(zhì)細(xì)胞均有顯著抑制作用，對(duì)已經(jīng)處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細(xì)胞只有輕微抑制作用。
　　 為了進(jìn)一步研究抗C

8、D81抗體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制作用的時(shí)效關(guān)系，第三部分研究了抗CD81抗體作用不同時(shí)間后對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖抑制的作用。將純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)12小時(shí)后，加入抗CD81抗體（4μg/ml），分別作用18小時(shí)，32小時(shí)及96小時(shí)后，以MTT比色法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活性，計(jì)算抑制率；以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相。MTT法檢測(cè)結(jié)果表明與對(duì)照組相比，抗CD81抗體作用18小時(shí)，32小時(shí)及96小時(shí)后均對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有顯著抑制作用，其抑制率分別為

9、11.17％，13.17％，27.49％。流式檢測(cè)結(jié)果表明抗CD81抗體作用18小時(shí)后，S期細(xì)胞指數(shù)與對(duì)照組相比，增加了16.09，星形膠質(zhì)細(xì)胞主要被阻滯于S期；作用32小時(shí)后，G0/G1期細(xì)胞指數(shù)與對(duì)照組相比增加了3.08；96小時(shí)后，細(xì)胞指數(shù)與對(duì)照組相比增加了5.87，細(xì)胞主要滯留于G0/G1期，即抗CD81抗體作用不同時(shí)間后均對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有顯著抑制作用，抑制作用隨時(shí)間增加而增強(qiáng)。早期抗CD81抗體使星形膠質(zhì)細(xì)胞阻滯于S期，隨著作

10、用時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸使細(xì)胞阻滯于G0/G1期。
　　 結(jié)論：星形膠質(zhì)細(xì)胞的接觸抑制不是由可溶性因子所引起，而是由星形膠質(zhì)細(xì)胞間的相互接觸誘發(fā)了增殖抑制機(jī)制所引起的。處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細(xì)胞分離去接觸后，細(xì)胞又恢復(fù)了增殖能力。而再次相互接觸時(shí)，細(xì)胞增殖又受到抑制?？笴D81抗體對(duì)處于低匯合和半?yún)R合的星形膠質(zhì)細(xì)胞均有顯著抑制作用，對(duì)已經(jīng)處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細(xì)胞只有輕微抑制作用。抗CD81抗體作用不同時(shí)間后均對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有顯著抑制