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文檔簡(jiǎn)介
1、本文以番茄葉霉病菌為試驗(yàn)菌種,對(duì)殼聚糖的抑菌活性及其機(jī)制進(jìn)行了研究。揭示了殼聚糖抑制番茄葉霉病菌的作用階段,研究了不同因素對(duì)殼聚糖抑菌活性的影響,推測(cè)了不同分子量殼聚糖的抑菌機(jī)理;檢測(cè)了殼聚糖誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生對(duì)番茄葉霉病的抗性,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了研究,為殼聚糖作為生物農(nóng)藥的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。測(cè)定了殼聚糖對(duì)番茄生長(zhǎng)發(fā)育及其產(chǎn)量和品質(zhì)的影響,為殼聚糖在番茄生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。 一、殼聚糖樣品的制備 用醋酸降解的方法制備了一
2、系列不同分子量(38 KDa-1540 KDa)的殼聚糖樣品,且這些樣品的脫乙酰度均為80%左右;采用醋酸酐乙?;ㄖ频靡幌盗胁煌撘阴6?73%-95%)的殼聚糖樣品,其分子量均在1600 KDa左右;并用紅外分光光度計(jì)(FT/IR-430)進(jìn)行了紅外圖譜檢測(cè)。 二、殼聚糖體外抑菌及其機(jī)理 用含毒介質(zhì)法測(cè)定了分子量、脫乙酰度、溶劑、環(huán)境pH值及濃度對(duì)殼聚糖抑制番茄葉霉病菌活性的影響。結(jié)果表明,殼聚糖對(duì)番茄葉霉病菌的孢子
3、萌發(fā)和菌絲體生長(zhǎng)均具有明顯抑制作用,對(duì)產(chǎn)孢量影響不顯著。在研究范圍內(nèi),隨濃度的增加和環(huán)境pH值降低,抑菌活性增強(qiáng);使殼聚糖具有較好抑菌效果的溶劑是乳酸和醋酸;脫乙酰度為86%、分子量為213 KDa-499 KDa的殼聚糖抑菌效果較好。室內(nèi)藥效試驗(yàn)證明:低濃度殼聚糖對(duì)番茄葉霉病菌的抑菌效果不及三唑酮、多菌靈等常用殺菌劑;但當(dāng)濃度達(dá)到2 mg/ml時(shí),它們的藥效相當(dāng)。 用光鏡、電鏡和激光共聚焦顯微鏡對(duì)不同分子量殼聚糖的抑菌機(jī)制進(jìn)行
4、了研究。光鏡觀察結(jié)果表明,濃度為0.5 mg/ml,分子量為82 KDa(CTS3)和1320 KDa(CTS7)的殼聚糖使菌絲體出現(xiàn)腫脹、分支增多、體細(xì)胞變短等形態(tài)學(xué)變化。掃描電鏡觀察,0.5 mg/ml的CTS3處理的菌絲體,腫脹但表面光滑,可能是殼聚糖進(jìn)入了菌絲體內(nèi)部;而CTS7處理的菌絲體,腫脹并且表面粗糙,殼聚糖凝聚在菌絲體周圍,形成了一層高分子膜。用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步觀察證明: 濃度為0.5 mg/ml、分子量小
5、于499 KDa的殼聚糖能夠進(jìn)入番茄葉霉病菌體內(nèi);而分子量為1320 KDa的殼聚糖被阻擋在了菌絲體外面,從而推測(cè)不同分子量殼聚糖具有不同的抑茵機(jī)制。測(cè)定了殼聚糖對(duì)番茄葉霉病菌的滲透勢(shì)和幾丁質(zhì)酶活的影響。結(jié)果表明,殼聚糖處理后,在90 min內(nèi)菌絲體的相對(duì)滲透勢(shì)增加最快,其幾丁質(zhì)酶活也有一定程度的提高,闡明了殼聚糖的抑菌機(jī)制與其增加菌絲體細(xì)胞膜的透性和幾丁質(zhì)酶活有關(guān)。 三、殼聚糖誘導(dǎo)番茄對(duì)番茄葉霉病的抗性及其機(jī)理 用不同
6、分子量和不同濃度的殼聚糖對(duì)番茄進(jìn)行抗性誘導(dǎo)后接種,可在一定程度上誘導(dǎo)番茄植株產(chǎn)生對(duì)番茄葉霉病的抗性。隨殼聚糖濃度及其分子量的增加,誘導(dǎo)效果均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),5 mg/ml左右的濃度、分子量為213 KDa的殼聚糖誘導(dǎo)效果較好;葉面噴施的誘導(dǎo)效果優(yōu)于浸種。葉面噴施濃度為5 mg/ml,分子量為213 KDa(CTS5)的殼聚糖誘導(dǎo)后,其相對(duì)防效達(dá)53.77%;而同濃度的CTS5浸種處理,相對(duì)防效為29.96%。 殼聚糖浸種和葉
7、面噴施均能不同程度地誘導(dǎo)番茄葉片中過(guò)氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性增加,但不同分子量殼聚糖、在不同濃度下、采用不同的處理方式對(duì)各種酶的作用效果不同,不同酶的時(shí)序變化也存在差異。 ①,兩種不同分子量的殼聚糖浸種處理,隨其濃度的增加,POD、PPO及β-1,3-葡聚糖酶的變化規(guī)律基本一致,而PAL和幾丁質(zhì)酶的變化規(guī)律不同。對(duì)于POD,CTS3的誘導(dǎo)效果好于CT
8、S7,而對(duì)于PPO、PAL、幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶,CTS7好于CTS3;CTS7在濃度分別為0.313、0.625、0.313、5、20 mg/ml時(shí),POD、PPO、PAL、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶達(dá)最大值;而CTS3在濃度為0.313 mg/ml時(shí),POD、PPO、PAL和β-1,3-葡聚糖酶達(dá)最大值,1.25 mg/ml時(shí),幾丁質(zhì)酶達(dá)最大值。 ②五種不同分子量的殼聚糖葉噴處理,CTS5對(duì)POD、PAL和β-
9、1,3-葡聚糖酶的誘導(dǎo)效果較好,而分子量為3 KDa的殼聚糖(CTSl)和CTS3分別對(duì)PPO和幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)效果較好。CTS5在濃度為6 mg/ml時(shí),POD和PAL達(dá)最大值;3 mg/ml時(shí),β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶達(dá)最大值;10 mg/ml,PPO達(dá)最大值。CTS5處理,POD、PPO、PAL、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶分別在第5、2、3、1、2 d達(dá)最大值。③對(duì)于CTS3和CTS7兩種殼聚糖,在5 mg/ml的濃度下,
10、浸種處理時(shí),CTS7比CTS3的誘導(dǎo)效果好;而葉噴處理,除PAL外,對(duì)其余四種酶的誘導(dǎo)效果,CTS3好于CTS7。葉噴處理比浸種處理對(duì)五種酶的誘導(dǎo)效果更好。 CTS5噴施次數(shù)對(duì)不同酶的影響不同:噴施一次PAL、幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性增幅最大;噴施兩次POD活性增幅最大:噴施三次PPO的活性增幅最大。 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,噴施殼聚糖CTS5后,PPO及PAL屬于系統(tǒng)獲得性誘導(dǎo),而POD、幾丁質(zhì)酶和β-1,3
11、-葡聚糖酶屬于局部獲得性誘導(dǎo)。 用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對(duì)不同處理的番茄葉片內(nèi)總蛋白、POD和PPO同工酶進(jìn)行了分析。電泳圖譜顯示,總蛋白主要表現(xiàn)在區(qū)帶數(shù)目和著色深淺的不同:在殼聚糖葉噴次數(shù)對(duì)總蛋白的影響試驗(yàn)中,葉噴一、二次的處理,分別關(guān)閉或加強(qiáng)了某些基因的表達(dá);葉噴三次的處理,只是加強(qiáng)了某些基因的表達(dá)。在不同分子量殼聚糖對(duì)總蛋白的影響中,CTSl的處理少兩條帶,CTS3、CTS7、CTS8少一條帶,說(shuō)明他們關(guān)閉了某些基
12、因的表達(dá);CTS5與對(duì)照數(shù)目相當(dāng),著色略深,說(shuō)明CTS5只是加強(qiáng)了某些蛋白的表達(dá)。不同殼聚糖濃度對(duì)總蛋白的影響中,6mg/mlCTS5處理的譜帶著色最深,說(shuō)明該濃度CTS5最能加強(qiáng)某些蛋白的表達(dá)。而POD和PPO同工酶譜帶主要是著色深淺的區(qū)別,其主帶強(qiáng)弱變化基本與相應(yīng)的酶活性一致,但沒有發(fā)現(xiàn)新酶帶的增加。 葉噴殼聚糖對(duì)番茄葉片活性氧影響的試驗(yàn)結(jié)果表明,葉面噴施殼聚糖4 h后,出現(xiàn)活性氧爆發(fā)的現(xiàn)象;16 h后,又出現(xiàn)抑制氧自由基產(chǎn)
13、生的現(xiàn)象,推測(cè)殼聚糖對(duì)番茄的誘導(dǎo)抗性與活性氧的變化有一定關(guān)系。 藥效試驗(yàn)結(jié)果顯示,殼聚糖與三唑酮混施,對(duì)番茄葉霉病的防治效果明顯優(yōu)于生產(chǎn)上通常使用的多菌靈和三唑酮。10 mg/ml殼聚糖與500倍三唑酮的防效相當(dāng)。 四、殼聚糖對(duì)番茄生長(zhǎng)發(fā)育的影響 以番茄(合作908)為試材,研究了殼聚糖對(duì)番茄種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)等的影響。結(jié)果表明:一定濃度的殼聚糖能夠明顯促進(jìn)種子萌發(fā)、提高番茄幼苗質(zhì)量和促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育,
14、具有一定的增產(chǎn)效果,并能夠不同程度的改善番茄果實(shí)中可溶性固形物、Vc含量、總蛋白含量和總酸度,改善果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與風(fēng)味;并且,不同分子量殼聚糖的作用效果不同。①適宜濃度殼聚糖能促進(jìn)番茄種子萌發(fā)。大田發(fā)芽試驗(yàn),大分子量的CTS7和小分子量的CTS3分別在1.25 mg/ml和2.5 mg/ml濃度下,發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)三項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)最大值。而室內(nèi)發(fā)芽試驗(yàn),CTS7和CTS3分別在0.625mg/ml和1.25 mg/ml的濃度下,三項(xiàng)
15、指標(biāo)達(dá)最大值;在室內(nèi)試驗(yàn)中,大分子量的CTS7效果最差,中間分子量CTS3和CTS5效果最好。大田發(fā)芽試驗(yàn)比室內(nèi)試驗(yàn)成苗率明顯高。②殼聚糖對(duì)番茄幼苗的株高和鮮重影響顯著,但對(duì)根長(zhǎng)和根鮮重影響達(dá)不到顯著水平的差異。浸種處理,CTS7在0.625~2.5 mg/ml之間對(duì)番茄生長(zhǎng)的促進(jìn)效果較為明顯,在2.5 mg/ml達(dá)到最大值;CTS3在1.25~5mg/ml之間對(duì)番茄生長(zhǎng)的促進(jìn)效果較為明顯,在5 mg/ml達(dá)到最大值。葉噴處理,CTS7
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