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文檔簡介
1、本課題在體外模擬內(nèi)異癥盆腹腔微環(huán)境,和體內(nèi)動物實驗為研究手段,擬研究ESC和巨噬細胞來源的IL-27通過何種信號通路和下游轉錄因子介導這群Th17細胞分化,進一步解析這群細胞是否通過IL-17A和IL-10促進內(nèi)異癥進展及病理機制。
第一部分 子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔免疫微環(huán)境特征
目的:1.分析生育期健康女性及子宮內(nèi)膜異位癥患者盆腹腔免疫微環(huán)境免疫特征。2.促炎性IL-17A及耐受性IL-10細胞對子宮內(nèi)膜間質細胞功
2、能的調控。
方法:分別收集生育期健康女性及子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液,應用離心法分離腹腔免疫細胞和腹腔液,采用Flow Cytometry檢測腹腔液免疫細胞亞群特征,Cytometric Bead Array、ELISA技術檢測腹腔液細胞因子的表達特征。
結果:流式細胞術研究發(fā)現(xiàn),CD4+Th17及Treg細胞在腹腔微環(huán)境中共同存在。
結論:子宮內(nèi)膜異位癥早期(Ⅰ-Ⅱ期)以促炎性免疫應答為主,炎癥貫穿疾病始終
3、,隨著疾病進展,晚期(Ⅲ-Ⅳ期)抗炎性免疫應答逐漸產(chǎn)生,逐漸形成免疫耐受優(yōu)勢格局。
第二部分 經(jīng)異位灶ESCs訓導的單核巨噬細胞對Th17細胞分化發(fā)育的影響
目的:1.體外模擬子宮內(nèi)膜異位灶微環(huán)境的分子特征。2.經(jīng)異位灶ESC訓導的單核巨噬細胞對Th17細胞及IL-10+Th17細胞分化發(fā)育的調節(jié)機制。
方法:原代培養(yǎng)正常(Normal ESCs),在位(Eutopic ESCs)及異位子宮內(nèi)膜間質細胞Ec
4、topic ESCs),免疫磁珠分選女性外周血單核細胞及外周幼稚T細胞,細胞純度鑒定>95%。將3種不同的ESCs分別與外周血單核細胞共培養(yǎng),建立E-M共培養(yǎng)系統(tǒng),單核細胞單獨培養(yǎng)或經(jīng)過LPS(100ng/ml)、PGE2(1uM)處理。免疫磁珠分選女性外周血單核細胞,細胞純度鑒定>95%,體外培養(yǎng)的外周血單核細胞,經(jīng)TCDD或雌孕激素處理48小時后,采用流式細胞術檢測IL-27p28表達水平。
結果:Bio-plex Arr
5、ay技術分析發(fā)現(xiàn),不同ESCs與外周血單核細胞共培養(yǎng)過程中,ectopic ESCs組分泌高水平的IL-27,TGF-β1,GM-CSF,RANTES,其中GM-CSF促進單核細胞分化成熟,而RNATES則招募更多的單核巨噬細胞至異位灶局部。采用免疫組織化學及流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)異位灶間質細胞高表達IL-27;外周血單核細胞經(jīng)TCDD或雌孕激素處理48小時后,高表達IL-27。與normal ESCs相比,ectopic ESCs表達更高
6、水平IL-27,eutopic ESCs表達低水平的IL-27。
結論:體外模擬的異位灶微環(huán)境高表達IL-27,IL-6,TGF-β1因子。
第三部分 異位灶IL-27間接抑制促炎性Th17細胞分化發(fā)育的分子機制
目的:1.過表達IL-27的ESCs與單核細胞共培養(yǎng),體外模擬異位灶微環(huán)境,解析巨噬細胞功能表型變化。2.經(jīng)過表達IL-27的ESCs所處理的單核巨噬細胞間接調控Th17細胞的分化。
方
7、法:免疫磁珠分選女性外周血單核細胞及幼稚T細胞,單核細胞與轉染后ESCs共培養(yǎng)。共培養(yǎng)48小時后,收集共培養(yǎng)體系中1/2“訓導過”的單核巨噬細胞,加入Trizol,提取RNA;體外培養(yǎng)單核細胞,加入IL-2或IL-27的中和性抗體,利用ELISA及流式細胞術對上述結果進行驗證。利用IntAct數(shù)據(jù)庫預測Aiolos與Foxp3關系。
結果:我們利用IntAct數(shù)據(jù)庫預測,發(fā)現(xiàn)Aiolos與Foxp3之間是負性調控關系,Aiol
8、os可抑制Foxp3表達與功能,推測Aiolos可能介導局部微環(huán)境中Th17與Treg分化平衡的偏移。
結論:異位灶微環(huán)境中IL-27促使單核細胞進一步高表達IL-27和IL-2,間接介導免疫耐受微環(huán)境的形成。
第四部分 異位灶IL-27直接調控IL-10+Th17細胞分化發(fā)育的分子機制
目的:1.解析IL-27對CD4+IL-10+T細胞分化的影響。2.解析IL-27直接調控IL-10+Th17分化發(fā)育的
9、分子機制。3.動物實驗驗證。
方法:免疫磁珠分選女性外周血單核細胞或幼稚T細胞,細胞純度鑒定>95%,α-CD3/α-CD28預包被96孔板4℃孵育16小時,在Th1,Th2,Treg,Th17誘導極化條件下,利用流式細胞術分析各亞群細胞c-MAF表達水平。
結果:IL-6+TGF-β1誘導較高比例的總CD4+Th17細胞分化,及低水平的IL-10+Th17細胞。動物實驗證實,拮抗腹腔中IL-27,能夠抑制異位灶IL
10、-10+Th17細胞的分化。
結論:異位灶ESCs高表達IL-27;TCDD及雌孕激素促進單核細胞高表達IL-27;IL-27可直接抑制naive T向總CD4+Th17細胞分化,但特異性促進IL-10+Th17細胞分化;當Th17極化背景下同時存在IL-27,IL-27抑制促炎性Th17細胞分化,同時還通過MAF/PRDM1通路促進IL-10表達,特異性誘導IL-10+Th17細胞分化,參與調控Th17細胞功能可塑性及微環(huán)境
11、免疫耐受偏移。
第五部分 IL-10+Th17細胞參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制
目的:1.人重組IL-17A對ESC的生物學行為調控。2.人重組IL-17A聯(lián)合IL-10對ESC的生物學行為調控。3.動物實驗驗證。
方法:分別收集正常生育期健康女性及子宮內(nèi)膜異位癥正常、在位子宮內(nèi)膜組織及腹腔異位灶組織,應用膠原酶消化、密度梯度離心法分離、培養(yǎng)正常,在位及異位子宮內(nèi)膜間質細胞(ESCs)。流式鑒定ESCs自身
12、IL-17AR的表達。體外培養(yǎng)并饑餓處理6小時后,分別用不同濃度IL-17A、IL-10、IL-17A聯(lián)合IL-10處理48小時,采用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B,SRB)比色法檢測細胞活力,AnnexinⅤ-FITC/PI檢測凋亡;利用Transwell檢測ESCs侵襲能力,粘附試驗盒檢測粘附能力.
動物實驗體內(nèi)驗證:利用C57小鼠建模,分為ctrl,IL-27拮抗組,IL-17A拮抗組,IL-10拮抗組,
13、IL-17A及IL-10聯(lián)合拮抗組,每組10只,10%水合氯醛麻醉后,將小鼠自體子宮切為均勻4塊,約2*2*2cm大小,用7/0絲線縫在下腹部及盆腔腹膜上,5/0絲線縫合腹部傷口。術后2mg/L17β-雌二醇溶液肌注1次,腹腔分別注射中和性抗體50ug,抗生素連續(xù)肌注3天預防感染。1周后,重復腹腔注射中和性抗體50ug;2周后通過頸椎脫臼法處死建模小鼠,縱行剖開小鼠腹腔,收集每只小鼠異位病灶并利用流式細胞術檢測異位病灶IL-10+Th1
14、7細胞的分化發(fā)育水平。
結果:ESCs表達IL-17A的受體;單獨IL-17A促進3種ESCs細胞活力,促進正常ESCs及在位eutopic ESCs凋亡,而抑制異位ectopic ESCs凋亡;單獨IL-17A促進正常ESCs及在位eutopic ESCs侵襲能力,抑制異位ectopic ESCs侵襲能力;而單獨IL-17A均降低3中ESCs的粘附能力。而單獨IL-10可增加正常ESCs的細胞活力,粘附能力和侵襲能力;IL-
15、17A及IL-10聯(lián)合則進一步增加正常ESCs的細胞活力和侵襲能力。動物實驗證實,同時拮抗盆腹腔中IL-17A及IL-10因子,能夠顯著抑制異位灶生長。
結論:IL-10+Th17細胞通過功能分子IL-10和IL-17A促進EMS進展。
綜上所述,異位灶微環(huán)境中IL-27作用于單核巨噬細胞和T細胞,在病灶局部產(chǎn)生利于免疫耐受的微環(huán)境。本課題為Th17細胞在子宮內(nèi)膜異位灶微環(huán)境中的分化發(fā)育中闡明了新的分子機制,為解析子
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