有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的普拉克索吸收與排泄機(jī)制研究.pdf

1、近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，存在于人體組織細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子結(jié)構(gòu)和功能逐漸為人們所認(rèn)識，它們在營養(yǎng)物質(zhì)及藥物的吸收或外排過程中起著十分重要的作用，并且具有高度的選擇性和特異性。有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（Organic cation transporters，OCTs）表達(dá)于腎臟、肝臟和小腸，可以介導(dǎo)許多內(nèi)源性胺類和藥物的吸收與消除。OCT的底物分布廣泛，臨床應(yīng)用的藥物大約有50％是有機(jī)陽離子藥物，包括抗心律失常藥、抗帕金森藥、抗

2、組胺藥、β-腎上腺素受體拮抗藥等。普拉克索（pramipexole，PPX）在生理?xiàng)l件下是以有機(jī)陽離子的形式存在的，但OCT介導(dǎo)的PPX體內(nèi)過程研究尚不清楚。因此，本課題擬研究 OCT在 PPX黏膜吸收和腎臟排泄中的作用，并探討OCT介導(dǎo)的PPX與西咪替丁發(fā)生藥物相互作用的風(fēng)險。
　　本文首先建立了PPX在不同生物基質(zhì)中的LC-MS/MS定量分析方法。選用d3-PPX作為內(nèi)標(biāo)，分別采用蛋白沉淀結(jié)合弱陽離子交換固相萃?。⊿olid

3、phase extraction，S P E）和乙酸乙酯液液萃取的方法處理組織樣品和其它生物基質(zhì)，并通過柱后推注法、預(yù)處理后加樣法、源內(nèi)多反應(yīng)監(jiān)測（In-source multiple reaction monitoring，IS-MRM）直接評價甘油磷酸膽堿（Glycerophosphocholines，GPChos）和溶血甘油磷酸膽堿（Lyso-glycerophosphocholines，Lyso-GPChos）的方法系統(tǒng)評價了基

4、質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生和消除機(jī)制，成功解決了組織樣品中內(nèi)源性成分對分析測定的干擾。采用Ultimate? XB-CN柱進(jìn)行色譜分離，分析時長僅為3.0 min，保證了高通量的樣品分析。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明P P X的血漿和組織樣品在0.05-100 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r>0.99，低、中、高三個QC濃度測定的日內(nèi)、日間精密度（RSD）均小于10.6%，血漿和腦組織的準(zhǔn)確度分別為95.2%~105.6%和91.4%~108.2

5、%，提取回收率在80.7%~90.3%的范圍內(nèi)，基質(zhì)效應(yīng)偏差為-13.8%~-1.2%，不同條件下穩(wěn)定性的偏差在±15%的范圍內(nèi)，各項(xiàng)指標(biāo)均符合生物樣品分析方法驗(yàn)證的相關(guān)要求。表明該方法準(zhǔn)確、靈敏，可以滿足體內(nèi)、體外相關(guān)試驗(yàn)的需求。
　　為考察 OCT在 PPX腸道吸收中可能發(fā)揮的作用，本課題利用擴(kuò)散池模型研究了PPX在大鼠十二指腸、空腸及回腸的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)情況，并通過不同種類的抑制劑試驗(yàn)初步推測PPX可能的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。結(jié)果顯示在1-5

6、0μM的濃度范圍內(nèi)，PPX從AP-BL側(cè)（黏膜側(cè)-漿膜側(cè)）和BL-AP側(cè)（漿膜側(cè)-黏膜側(cè)）跨大鼠不同腸段的累計通透量均呈線性，且分泌方向要高于吸收方向。在回腸中，加入有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑（金剛烷胺、胍、普魯卡因胺、四乙胺、奎寧和維拉帕米）后，PPX的累計通透量明顯降低。但是，在十二指腸和空腸的試驗(yàn)中，只有部分抑制劑有抑制效果，表明OCT可能介導(dǎo)了PPX在大鼠腸道的外排轉(zhuǎn)運(yùn)，且其在小腸的表達(dá)存在區(qū)域性差異。此外，其他轉(zhuǎn)運(yùn)體（如P-gp）

7、也可能參與PPX的轉(zhuǎn)運(yùn)過程?？傊?，上述結(jié)果提示有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體對PPX腸道吸收的貢獻(xiàn)較小，提示OCT介導(dǎo)的PPX口服吸收過程中產(chǎn)生臨床DDI的風(fēng)險較低。
　　由于帕金森疾?。≒arkinson’s disease，PD）的病變部位位于顱內(nèi)，PPX口服給藥后藥物需要透過腸黏膜吸收進(jìn)入體循環(huán)后進(jìn)而跨過血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）才能實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)遞藥，這將會使藥物向腦內(nèi)的遞送速率和遞送量大大下降，極大地限制了P

8、PX對PD的治療?；谏鲜隹紤]，我們嘗試通過改變給藥方式來增加PPX向腦內(nèi)的遞送。鼻腔和腦在生理學(xué)上存在獨(dú)特的聯(lián)系，且鼻腔給藥后藥物可以直接通過“鼻-腦”通路繞過BBB進(jìn)入腦內(nèi)，從而增加藥物的腦內(nèi)遞藥。因此，接下來考察了PPX鼻黏膜給藥后實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)“靶向”遞藥的可能性。通過小鼠腦組織勻漿法和切片法研究 PPX靜脈給藥、口服給藥和鼻腔給藥后在血漿和腦組織中的藥動學(xué)過程，并采用ADAPT5軟件對主要的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行了擬合。模型擬合結(jié)果顯示靜脈

9、給藥和口服給藥后PPX在體內(nèi)呈一級動力學(xué)過程，鼻腔給藥后藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)為飽和吸收過程，但被動擴(kuò)散也可能是轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制之一，且約有20%的藥物是通過“鼻-腦”通路直接轉(zhuǎn)運(yùn)入腦的。與口服給藥相比，鼻腔給藥后腦內(nèi)PPX的達(dá)峰時間從1 h提前至30 min，Cmax由14.65±0.43 ng/g增加至20.37±6.30 ng/g，腦靶向效率為口服給藥組的1.3倍，證明鼻腔給藥可以更快地實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)遞藥，提高腦內(nèi)藥物濃度。小鼠冠狀腦切片模型結(jié)果顯示鼻腔給

10、藥后2 min-20 min每個取樣時間點(diǎn)，腦內(nèi)藥物濃度的變化趨勢呈先下降后上升的趨勢（從“頭”到“尾”），符合鼻腔給藥的特點(diǎn)。上述結(jié)果提示對PPX而言，鼻腔給藥比口服給藥更有優(yōu)勢，而且鼻腦直接轉(zhuǎn)運(yùn)通路對PPX轉(zhuǎn)運(yùn)入腦發(fā)揮了重要作用。
　　在PPX鼻腔給藥的藥動學(xué)研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了PPX跨鼻黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制。采用牛鼻黏膜離體組織模型和相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)考察了 OCT在 PPX跨牛鼻黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。結(jié)果顯示PPX在牛嗅黏膜M

11、-S方向（黏膜側(cè)-黏膜下側(cè)）的轉(zhuǎn)運(yùn)呈飽和趨勢，且高于S-M（黏膜下側(cè)-黏膜側(cè)）方向，米氏方程擬合后，最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率Jmax為18.62±5.46 ng cm-2 min-1，Km值為44.66±22.65μM。而在呼吸黏膜中兩個方向的轉(zhuǎn)運(yùn)速率基本一致。加入不同種類的有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑后，PPX在嗅黏膜中的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取過程均被抑制，而在呼吸黏膜中，只有攝取被抑制，轉(zhuǎn)運(yùn)速率無顯著變化。提示OCTs尤其是OCT1和OCT2可能主要介導(dǎo)了PPX

12、跨嗅黏膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，但在其跨呼吸黏膜的吸收過程中貢獻(xiàn)較小。孵育介質(zhì)不同離子組成對PPX跨牛嗅黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)運(yùn)過程依賴于跨膜電勢，但不依賴于pH梯度和鈉離子，進(jìn)一步從轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制層面證明了OCT介導(dǎo)了PPX跨鼻黏膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，通過Western Blot技術(shù)和免疫組化技術(shù)考察了OCT1和OCT2在牛鼻黏膜中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示OCT1和OCT2不僅表達(dá)在牛鼻黏膜的頂膜側(cè)（黏膜側(cè)），還分布在黏膜下的廣大區(qū)域，如血管、腺體、淋

13、巴管等，提示這可能與腎臟中OCT1和OCT2的作用相似，主要協(xié)助PPX進(jìn)入或離開這些區(qū)域。
　　對于PPX這個有機(jī)陽離子化合物而言，OCT在其腸道吸收過程中存在一定的作用，而在牛鼻黏膜的轉(zhuǎn)運(yùn)中也發(fā)揮著重要作用，這提示我們可以充分利用OCT這個作用靶點(diǎn)進(jìn)行藥物設(shè)計或遞送。此外，OCT在腎臟也高度表達(dá)，PPX吸收后在體內(nèi)的處置過程是否也跟OCT有關(guān)是一個非常值得我們關(guān)注的問題。因此，研究了腎臟OCT介導(dǎo)的PPX排泄機(jī)制，選擇臨床常用藥

14、物西咪替?。∣CT的底物和競爭性抑制劑）為合并用藥藥物，采用整體動物模型、離體腎切片模型及轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型考察西咪替丁對PPX腎臟排泄的影響，并探討兩者發(fā)生藥物相互作用的風(fēng)險和機(jī)制。整體動物的藥動學(xué)研究表明當(dāng)西咪替丁與PPX同時給藥后，與對照組相比PPX的血漿AUC(0-12h)增加了2.45倍，平均血漿清除率下降了2.30倍，而PPX在24 h內(nèi)的累積尿藥排泄量顯著下降，腎臟清除率下降了3倍。表明西咪替丁抑制了PPX的腎臟排泄和在血漿中的

15、清除，提示在腎臟排泄過程中，PPX和西咪替丁是由相同的轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)介導(dǎo)的，臨床合用西咪替丁可能降低PPX的腎排泄作用。腎切片試驗(yàn)表明OCT抑制劑胍（1 mM）、西咪替丁（0.5 mM和1 mM）以及0.1 mM-1 mM濃度范圍的TEA均對PPX的腎臟攝取有顯著抑制作用，且具有濃度依賴性，提示這種相同的轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)與OCT相關(guān)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步從分子水平證明了西咪替丁是通過抑制OCT2而影響PPX腎臟排泄的，且西咪替丁的Cu,max/IC