桿狀病毒載體介導(dǎo)鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體報(bào)告基因監(jiān)測(cè)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討桿狀病毒作為載體鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（NIS）基因作為報(bào)告基因監(jiān)測(cè)干細(xì)胞的可行性。
　　 方法：通過(guò)Bac-to-Bac方法重組GFP及NIS桿狀病毒（Bac–GFP 及Bac–NIS），以不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的重組綠色熒光蛋白（GFP）基因桿狀病毒（Bac-GFP）分別感染誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell,iPS）、人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cel

2、ls， hESC）及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs), 分別通過(guò)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀測(cè)定干細(xì)胞的感染效率及熒光表達(dá)強(qiáng)度、熒光顯微鏡觀察干細(xì)胞的熒光表達(dá)時(shí)間以及臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)重組桿狀病毒對(duì)干細(xì)胞的毒性。通過(guò)重組NIS基因桿狀病毒（Bac-NIS）感染BMSCs，觀察不同MOI的Bac-NIS對(duì)干細(xì)胞攝125I的影響；Bac-NIS感染的干細(xì)胞不同時(shí)間攝125I和攝9

3、9mTcO4-功能的動(dòng)態(tài)測(cè)定以及感染干細(xì)胞攝125I的高氯酸鈉抑制實(shí)驗(yàn)；同時(shí)還進(jìn)行了Bac–NIS感染的干細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞攝碘的相關(guān)性研究。
　　 結(jié)果：成功制備了重組NIS和GFP基因的桿狀病毒，受CMV(巨細(xì)胞病毒)立早期基因啟動(dòng)子調(diào)控。重組GFP桿狀病毒MOI為200時(shí)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察iPS、hESC的感染效率大約為12％、27％；BMSCs的感染效率和熒光強(qiáng)度隨Bac-GFP MOI的增加而增加,當(dāng)MOI為200時(shí)，細(xì)

4、胞感染效率和熒光強(qiáng)度達(dá)最高，感染效率為84.2％，而MOI為100時(shí)細(xì)胞的感染效率即達(dá)78％；當(dāng)MOI為400時(shí)，細(xì)胞死亡數(shù)與對(duì)照組7天內(nèi)未見(jiàn)明顯差異；感染的BMSCs的熒光表達(dá)隨著時(shí)間逐漸降低，第5d可見(jiàn)74.6％的細(xì)胞表達(dá)，第12d仍有34.2％的細(xì)胞表達(dá)。
　　 Bac-NIS感染的BMSCs放射性125I攝取隨著MOI的增加而增加，MOI=200時(shí)，細(xì)胞攝碘達(dá)最高；而且細(xì)胞攝取的碘可隨高氯酸鈉濃度的增加而明顯抑制；細(xì)胞動(dòng)

5、態(tài)攝碘實(shí)驗(yàn)顯示，感染細(xì)胞的125I攝取隨著時(shí)間逐漸增加，30min達(dá)高峰，隨后逐漸排出；而感染細(xì)胞攝取的放射性高锝酸根（99mTcO4-）同樣隨著時(shí)間逐漸增加，30min達(dá)高峰，但高峰時(shí)間較125I維持相對(duì)較長(zhǎng),為15-45min,且排出也相對(duì)較慢。
　　 Bac-NIS感染的BMSCs數(shù)量與細(xì)胞放射性計(jì)數(shù)之間呈顯著的相關(guān)性，R2=0.99，表明通過(guò)放射性計(jì)數(shù)變化可間接表明BMSCs的數(shù)量，為活體內(nèi)示蹤和定量干細(xì)胞提供依據(jù)。