三種病毒載體對(duì)人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果及基因表達(dá)的對(duì)比研究.pdf

1、研究背景
　　 基因治療(Gene therapy)的出現(xiàn)為心血管疾病提供了一種潛在的重要治療手段，然而，心血管疾病基因治療的進(jìn)展一直不大，一個(gè)關(guān)鍵制約因素是缺乏高效的基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將基因治療局限于特定靶點(diǎn)，并能優(yōu)化轉(zhuǎn)基因表達(dá)和治療療效。研究發(fā)現(xiàn)人臍帶華通膠來(lái)源的問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)-人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord Wharton’s jelly

2、-derived MSCs，hUCMSCs)具有更多優(yōu)勢(shì)，有望成為臨床治療中的理想種子細(xì)胞。攜帶靶基因的hUCMSCs通過(guò)干細(xì)胞表面的干細(xì)胞因子感知病變區(qū)域信號(hào)，自動(dòng)向靶位遷移，在病變區(qū)域自我分化、自我更新，整合入干細(xì)胞的目的基因得以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，這樣既補(bǔ)充了經(jīng)遺傳基因修飾過(guò)的理想的“種子”細(xì)胞，也使靶基因有效調(diào)控病變組織的分子異常表達(dá)，將同時(shí)解決丟失的細(xì)胞、基因的運(yùn)輸、基因的靶向、基因的長(zhǎng)期表達(dá)等分子生物治療學(xué)的關(guān)鍵。這將是心血管疾病

3、治療的突破性進(jìn)展。
　　 基因轉(zhuǎn)染必須借助載體將外源基因?qū)肷锛?xì)胞，其最大障礙在于載體的安全性和有效性，對(duì)載體的研究以提高基因治療技術(shù)亦是必要的。
　　 研究目的
　　 1.分離培養(yǎng)并鑒定人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞，為后續(xù)基因轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備試驗(yàn)細(xì)胞；
　　 2.對(duì)比研究腺病毒(Adenoviruse，Ad)、重組腺相關(guān)病毒(Recombinant Adeno-Associated Virus，rAAV)、慢病毒

4、(Lentiviruse，LV)載體介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescentprotein，EGFP)基因?qū)θ四殠A通膠間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果及基因表達(dá)情況。
　　 研究方法
　　 1.取剖腹產(chǎn)無(wú)菌新鮮臍帶，采集華通膠組織，用組織塊貼壁法，接種于胎牛血清+DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞融合80％以上后傳代培養(yǎng)。同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞免疫表型(CD34、CD44、CD45、CD

5、73、CD90、CD105、HLA-ABC、HLA-DR)，并行成骨成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化等檢測(cè)；
　　 2.應(yīng)用介導(dǎo)EGFP基因的腺病毒(Ad5F35-mCMV-EGFP)、腺相關(guān)病毒(rAAV2-EGFP)、慢病毒(LN-EGFP)載體感染P3代人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞，在1、3、7、14、21天應(yīng)用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞EGFP表達(dá)情況，于7、14、21天收集感染細(xì)胞，應(yīng)用熒光定量PCR、Western Blotting方法檢測(cè)EG

6、FP基因及蛋白表達(dá)。
　　 研究結(jié)果
　　 1.人臍帶華通膠剪碎后，于胎牛血清+DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)1～2周左右，顯微鏡下可見(jiàn)組織塊間隙可見(jiàn)散在分布的長(zhǎng)梭形細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，3周左右可見(jiàn)細(xì)胞集落融合，融合達(dá)80％以上時(shí)傳代培養(yǎng)以1×10％cells/75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，3～5d細(xì)胞即融合可傳代，傳代觀察每代細(xì)胞形態(tài)與原代基本一致，增殖能力未見(jiàn)下降，最遠(yuǎn)傳代至20代；取P2代hUCMSC應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型

7、顯示：基質(zhì)細(xì)胞抗原CD44/CD73/CD90/CD105/HLA-ABC高表達(dá)，不表達(dá)造血干細(xì)胞抗原CD34/CD45及白細(xì)胞相關(guān)抗原HLA-DR；成骨成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化后酋素紅、堿性磷酸酶、油紅染色呈強(qiáng)陽(yáng)性。
　　 2.1)對(duì)hUCMSCs基因轉(zhuǎn)染中，腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒載體組最佳感染復(fù)數(shù)不同，分別為1×104、1×105、10,在最佳感染復(fù)數(shù)時(shí)，腺病毒較腺相關(guān)病毒、慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)

8、；
　　 2)最佳感染復(fù)數(shù)時(shí)，腺病毒組較腺相關(guān)病毒、慢病毒組的EGFP基因及蛋白表達(dá)量較高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；
　　 3)腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒三種病毒載體轉(zhuǎn)染hUCMSCs后EGFP基因及蛋白表達(dá)呈現(xiàn)不同規(guī)律，腺病毒載體組轉(zhuǎn)染6h即見(jiàn)熒光表達(dá)，而腺相關(guān)病毒、慢病毒組均于轉(zhuǎn)染后3～5d方可見(jiàn)熒光表達(dá)，腺病毒組EGFP基因不能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，腺相關(guān)病毒、慢病毒組EGFP基因持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，最遠(yuǎn)觀察至轉(zhuǎn)染5周

9、；
　　 4)腺相關(guān)病毒載體(rAAV2-EGFP)介導(dǎo)EGFP基因成功轉(zhuǎn)染hUCMSCs，提示不同腺相關(guān)病毒載體分型的轉(zhuǎn)染特性不同。
　　 研究結(jié)論
　　 1.應(yīng)用組織塊貼壁培養(yǎng)法可成功從人臍帶華通膠組織中提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞免疫表型及誘導(dǎo)分化驗(yàn)證符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(International society for cellular therapy，ISCT)規(guī)定的MSCs鑒定的最低標(biāo)準(zhǔn)；