植物多酚類化合物聯(lián)合阿霉素抑制MCF-7-ADM細(xì)胞的篩選及白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)耐藥性作用研究.pdf

1、乳腺癌是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至威脅生命的常見(jiàn)病與多發(fā)病，而腫瘤的多藥耐藥(MultidrugResistance，MDR)與化療的毒副反應(yīng)是臨床上制約乳腺癌患者化療的療效從而影響生存與預(yù)后的兩個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題。研究腫瘤MDR安全有效的逆轉(zhuǎn)劑是腫瘤化療中亟待解決的問(wèn)題，亦是目前腫瘤研究的難點(diǎn)及熱點(diǎn)領(lǐng)域。本研究從六種主要植物多酚類化合物中篩選出聯(lián)合阿霉素抑制人乳腺癌多藥耐藥MCF-7/ADM細(xì)胞作用較強(qiáng)的化合物；研究該化合物聯(lián)合阿霉素對(duì)MC

2、F-7/ADM細(xì)胞產(chǎn)生的具體效應(yīng)、增敏效果及增敏的可能原因；探討增敏的可能機(jī)制；最后通過(guò)建立荷耐藥移植瘤裸鼠模型來(lái)明確該化合物聯(lián)合阿霉素治療耐藥腫瘤細(xì)胞移植瘤的體內(nèi)效果。在篩選植物多酚類化合物中，我們率先嘗試應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)的方法，大大縮短實(shí)驗(yàn)周期，得到理想的篩選結(jié)果，證實(shí)均勻設(shè)計(jì)是多因素、多水平的試驗(yàn)的良好處理方法。 研究目的: 本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討植物多酚類化合物協(xié)同阿霉素抑制人乳腺癌多藥耐藥MCF-7/ADM細(xì)胞的

3、作用，為尋找逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的新藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法與結(jié)果:1.植物多酚類化合物聯(lián)合阿霉素抑制人乳腺癌多藥耐藥MCF-7/ADM細(xì)胞作用的篩選將六種植物多酚類化合物按配伍組設(shè)計(jì)，用MTT法初篩對(duì)MCF-7/ADM細(xì)胞具有抑制作用的植物多酚類化合物；再把初篩出的化合物和阿霉素經(jīng)均勻設(shè)計(jì)，篩出聯(lián)合阿霉素MCF-7/ADM細(xì)胞作用較強(qiáng)的化合物；最后用單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)檢測(cè)篩出的化合物聯(lián)合阿霉素對(duì)正常肝細(xì)胞的毒性作用。

4、 結(jié)果顯示：槲皮素、白藜蘆醇和阿魏酸對(duì)MCF-7/ADM細(xì)胞的10％抑制濃度(IC10)分別是7.41μmol/L、10.70μmol/L、12.30μmol/L，兒茶素、大豆苷元、芝麻素在128μmol/L濃度下均無(wú)作用(P>0.05)；均勻設(shè)計(jì)的結(jié)果表明聯(lián)合阿霉素(ADM)抑制MCF-7/ADM細(xì)胞的作用中，白藜蘆醇(Res)較槲皮素和阿魏酸明顯；SCGE試驗(yàn)證明12μmol/L白藜蘆醇和10μmol/L阿霉素不論是單用還是

5、聯(lián)合應(yīng)用均不會(huì)對(duì)正常肝細(xì)胞不會(huì)造成DNA的損傷。 2.白藜蘆醇對(duì)人乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究采用MTT法測(cè)MCF-7/ADM細(xì)胞的耐藥性及Res對(duì)MCF-7/S和MCF-7/ADM細(xì)胞的抑制作用；同時(shí)將ADM和Res聯(lián)合作用于MCF-7/ADM細(xì)胞，通過(guò)計(jì)算聯(lián)合作用后的抑制率IR％和半數(shù)抑制濃度IC50值，得出Q值和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，以判斷Res的抑瘤增效及逆轉(zhuǎn)作用；最后應(yīng)用熒光分光光度法檢測(cè)聯(lián)合用藥后MCF-7/AD

6、M細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的變化。 結(jié)果表明：ADM對(duì)MCF-7/S細(xì)胞IC50值為0.39μmol/L；對(duì)MCF-7/ADM細(xì)胞IC50值為21.38μmol/L；MCF-7/ADM細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為54.82倍；Res對(duì)MCF-7/S細(xì)胞IC10值為8.46μmol/L，Res對(duì)MCF-7/ADM細(xì)胞IC10值為11.39μmol/L，Res在兩種細(xì)胞之間無(wú)耐藥性(1.35倍)；從Res的抑瘤增效實(shí)驗(yàn)可知Res與ADM在體外均有相加或

7、增強(qiáng)作用，絕大多數(shù)聯(lián)合用藥組的Q>1.15，表明二者的作用主要表現(xiàn)為協(xié)同作用；同時(shí)Res具有提高M(jìn)CF-7/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)隨著Res濃度的增高而增加(ADM聯(lián)合4μmol/LRes時(shí)逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.950，聯(lián)合8μmol/LRes時(shí)逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.178，聯(lián)合12μmol/LRes時(shí)逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.355)；熒光分光光度法檢測(cè)結(jié)果提示：不論MCF-7/S細(xì)胞和MCF-7/ADM細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)ADM濃度均隨細(xì)胞外化療藥物A

8、DM濃度的增加而升高，且耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM內(nèi)ADM的濃度明顯低于敏感細(xì)胞MCF-7/S內(nèi)ADM的濃度(P<0.01)。當(dāng)加入Res后，與對(duì)照組相比，耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM內(nèi)ADM的濃度明顯升高(P<0.05)，且細(xì)胞內(nèi)ADM濃度均隨細(xì)胞外ADM濃度升高而升高。 3.白藜蘆醇增加人乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的機(jī)制探討通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)Res對(duì)MCF-7/ADM細(xì)胞mdr-1mRNA轉(zhuǎn)錄的影響，Wes

9、tem-blot方法檢測(cè)Res對(duì)MCF-7/ADM細(xì)胞mdr-1基因表達(dá)產(chǎn)物P-gp的影響，探討白藜蘆醇增加人乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞內(nèi)阿霉素蓄積性的機(jī)制。 結(jié)果提示:聯(lián)合治療后MCF-7/ADM細(xì)胞mdr-1基因表達(dá)和mdr-1基因表達(dá)產(chǎn)物P-gp表達(dá)量均較空白組、阿霉素組和白藜蘆醇組低(P<0.05)。 4.白藜蘆醇聯(lián)合阿霉素對(duì)荷耐藥移植瘤裸鼠的抑瘤作用研究建立小鼠乳腺癌模型后，經(jīng)腹腔注射不同藥物后，測(cè)定小鼠體重

10、、腫瘤體積和腫瘤重量，算出抑瘤率；并觀察用藥后的毒副作用；最后通過(guò)HE染色進(jìn)行腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:用藥6W后，ADM+Res組移植瘤體積(1.203±0.338)cm3明顯小于其余各組，抑瘤率為50.58％，與單用ADM組(1.979±0.307)cm3相比有差異(P<0.05)；腫瘤重量的結(jié)果與瘤體結(jié)果類似；未觀察到用藥后的毒副作用；經(jīng)不同處理后，單獨(dú)注射Res組小鼠體重較生理鹽水組及ADM組有所增加(P<0.

11、05)，而ADM+Res組治療前后體重?zé)o差異(P>0.05)；HE結(jié)果顯示與其他組相比，ADM+Res組腫瘤組織中出現(xiàn)大片壞死區(qū)域。 結(jié)論: 1.Res聯(lián)合ADM對(duì)人乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞具有抑制作用，且對(duì)正常組織基本無(wú)毒副作用； 2.Res能逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM細(xì)胞的多藥耐藥性，其原因與增加ADM藥物濃度有關(guān)； 3.Res可提高ADM在MCF-7/ADM細(xì)胞內(nèi)的蓄積的原因與下調(diào)MCF-7/ADM