小麥藍(lán)矮病植原體胸苷酸激酶基因（tmk）的分離、原核表達(dá)及酶活性分析.pdf

1、小麥藍(lán)矮病(Wheat Blue Dwarf,簡(jiǎn)稱(chēng)WBD)是我國(guó)首次報(bào)道的小麥植原體病害，國(guó)外尚未見(jiàn)報(bào)道，由介體條沙葉蟬(Psammotettix striatus L．)專(zhuān)化性傳播，是我國(guó)西北干旱、半干旱地區(qū)中熟麥區(qū)間作套種和麥草覆蓋小麥生產(chǎn)中的主要流行性病害，該病發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可使全田翻種絕收，給小麥糧食生產(chǎn)帶來(lái)巨大的損失。胸苷酸激酶(Thymidylate kinaLse，TMK，國(guó)際系統(tǒng)命名：EC 2.7.4.9)，在ATP為供體和

2、Mg2+參與的條件下，催化磷?；鶑腁TP轉(zhuǎn)移到脫氧胸苷酸(deoxythymidylic monophosphate，dTMP)形成dTDP，是植原體細(xì)胞三磷酸胸苷(dTTP)補(bǔ)救合成途徑的關(guān)鍵酶之一，用于DNA的合成、修復(fù)或線粒體DNA的復(fù)制。 由于植原體在寄主體內(nèi)含量低，又無(wú)法進(jìn)行分離培養(yǎng)，致使對(duì)該病原物的研究受到了一定的限制，因此，本文用分子生物學(xué)方法從小麥藍(lán)矮病植原體中將胸苷酸激酶基因(tmk)分離，進(jìn)行原核表達(dá)，親和純

3、化，并對(duì)純化的融合蛋白進(jìn)行了酶活性分析。研究結(jié)果如下： (1)小麥藍(lán)矮病植原體胸苷酸激酶基因(tmk)的分離：設(shè)計(jì)特異性引物，采用分子生物學(xué)方法對(duì)陜西韓城自然發(fā)病的小麥藍(lán)矮病植株進(jìn)行植原體胸苷酸激酶基因(tmk)擴(kuò)增，分離并克隆了2個(gè)tmk基因，trek-l和tmk-2，全長(zhǎng)分別為630bp和624bp，(G+C)含量分別為28.68％和28.37％，分別編碼209和207個(gè)氨基酸。所測(cè)序列已被Genbank收錄，其登錄號(hào)分別為

4、EU183350和EU183351。序列同源性分析表明，tmk-l基因與洋蔥黃化(OY)的tmk-a、三葉草綠變(CPh)，tmk-2與洋蔥黃化的tmk-b、翠菊黃化叢枝(AYWB)的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列同源率均達(dá)到94％以上，說(shuō)明小麥藍(lán)矮病植原體與16Sr I組植原體親緣關(guān)系較近。 (2)胸苷酸激酶基因的結(jié)構(gòu)特征：氨基酸序列的分析表明，WBD-TMK包含P-loop區(qū)、TMP結(jié)合區(qū)及LID區(qū)等3個(gè)與結(jié)合NTP/NMP

5、相關(guān)的保守功能區(qū)，說(shuō)明小麥藍(lán)矮植原體TMK-1和TMK-2在一級(jí)結(jié)構(gòu)上與已知TMK含有相同的功能區(qū)，由此推出它們可能行使同樣的TMK酶催化功能。但在TMK-1序列中，TMP結(jié)合區(qū)上參與重要作用的：DRY三肽中的Y被W取代，且P-loop區(qū)下游的和TMP結(jié)合區(qū)上游的N'-PAL-C'兩個(gè)高度保守區(qū)的缺失，可能會(huì)對(duì)TMK-1的酶活性有一定影響。 (3)胸苷酸激酶基因的原核表達(dá)：構(gòu)建了pET30-tmk和pBV221-tmk重組質(zhì)粒，

6、并進(jìn)行原核表達(dá)，SDS-PAGE分析表明tmk-1和tmk-2基因在大腸桿菌BL21(DE3)中均得到了高效表達(dá)。但pBV221-tmk重組質(zhì)粒表達(dá)的蛋白全為包涵體形式存在，故選擇pET30a原核表達(dá)載體。通過(guò)誘導(dǎo)溫度和時(shí)間的優(yōu)化，16℃誘導(dǎo)14h能產(chǎn)生較多的可溶性蛋白，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用Ni-NTA進(jìn)行親和層析純化，通過(guò)梯度洗脫，確定用含500mM咪唑的Elution Buffer洗脫收集目的蛋白。 (4)酶活性分析：結(jié)果表明TM

7、K-2融合蛋白活性較高，在酶濃度為211μg/ml時(shí)達(dá)到最高，酶活力為112.41 U/mg，該酶最適催化條件為1.5 mmol/L Mg2+，1 mmol/LATP，pH7.3左右，溫度32℃左右。TMK-1融合蛋白催化活性極低，酶活力僅1.64 U/mg，且其催化活性不隨六種影響因素梯度改變而變化。利用凝血酶將融合蛋白N端的His標(biāo)簽切去后，酶活性無(wú)太大變化，說(shuō)明融合蛋白N端的His標(biāo)簽部分對(duì)TMK-2的活性沒(méi)有影響，且并未抑制TM