糯玉米SSAP方法的建立及評(píng)價(jià).pdf

1、糯玉米起源于我國(guó)，是玉米屬玉米種的一個(gè)亞種。糯玉米經(jīng)數(shù)百年的變異，在株高、粒色、產(chǎn)量、抗性、品質(zhì)等方面都形成了較大差異，是我國(guó)寶貴的玉米種質(zhì)資源。糯玉米具有甜、粘、香的特點(diǎn)，風(fēng)味優(yōu)于普通玉米，其可溶性糖高于普通玉米而低于甜玉米，更適合當(dāng)前發(fā)達(dá)國(guó)家人們的口味要求。用糯玉米作為原料加工的產(chǎn)品，一定會(huì)以獨(dú)特的風(fēng)味豐富人們的食譜。因此，深入研究糯玉米的遺傳多樣性，對(duì)糯玉米的新品種選育具有重要的現(xiàn)實(shí)和理論價(jià)值。本研究主要以1997年由R．Waug

2、h等創(chuàng)立的特異序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-specific amplification polymorphisms，SSAP)為依據(jù)，在糯玉米上建立了此方法，為糯玉米種質(zhì)資源及遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 1、在綜合現(xiàn)有DNA提取方法和試驗(yàn)材料本身性質(zhì)的基礎(chǔ)上，對(duì)糯玉米基因組DNA提取進(jìn)行了了改進(jìn)：采用高鹽的2％CTAB裂解細(xì)胞；2％的可溶性PVP以及2％β-巰基乙醇除去酚；先用苯酚：氯仿：異戊醇抽提一次，再用氯

3、仿：異戊醇抽提一次除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；最后用RNase消化，去除RNA，得到純的DNA。此法提取的DNA其A260/A280的值介于1.8和2.0之間，A260，A230的比值大于2.0，且能被MseⅠ酶解完全，符合后續(xù)試驗(yàn)對(duì)DNA純度的要求。此DNA提取方法快速、高效、經(jīng)濟(jì)，提取的DNA質(zhì)量好，特別對(duì)樣品數(shù)量多、工作量大和時(shí)間緊迫的情況下尤為適用。 2、通過(guò)單酶切(MseⅠ)和雙酶切(EcoRⅠ、MseⅠ)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明了單酶切

4、不適合于糯玉米SSAP分析；在雙酶切試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用EcoRⅠ的引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增所得圖譜清晰、條帶質(zhì)量好、多態(tài)性高；同時(shí)證明現(xiàn)在人們多采用的高頻剪切酶的引物不適合于糯玉米SSAP分析，這與前人普遍采用的高頻剪切酶引物做SSAP分析不同。 3、初步建立了糯玉米的SSAP分析方法為： (1)酶切：EcoRI、MseI雙酶切。先用EcoRI在37℃下酶切3h(Buffer：3μl，EcoRI：0.5μl，DNA：500ng，dd

5、H2O補(bǔ)至15μl)。再加入MseI在65℃下酶切1h(Buffer：1μl，MseI：0.2μl，ddH2O:3.8μl)。取10μl用于下步。 (2)連接：用EcoR Ⅰ和MseⅠ的接頭進(jìn)行連接，22℃下連接2h(Buffer：2.0μl，Ead：0.5μl，Mad：0.5μl，T4 DNA連接酶：0.15μl，ddH2O補(bǔ)至10μl)。 (3)預(yù)擴(kuò)：反應(yīng)體系：10×Buffer：2.5μl，連接后DNA：2.4μl

6、，dNTPs(2.5mM)：1.6μl，EcoRI引物(25ng/μl)：4.0μl，MseⅠ引物(25ng/μl)：4.0μl，Taq DNA聚合酶：1U，ddH2O：補(bǔ)至25μl。反應(yīng)條件：94℃：5min，94℃：30s，56℃：1min，72℃：1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃：5min。預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物用TE稀釋4倍后，完成下面的步驟。 (4)選擇性擴(kuò)增：反應(yīng)體系：10×13uffer：1.01μl，dNTPs(2.5mM)：

7、0.8μl，預(yù)擴(kuò)后DNA：0.75μl，EcoRI引物(25ng/μl)：0.6μl，特異性引物(25ng/μl)：1.2μl，Taq DNA聚合酶：0.5U，ddH2O：補(bǔ)至10μl。反應(yīng)條件：94℃：5min，94℃：30s，65℃：30s(此步采用touchdown,每個(gè)循環(huán)降0.7℃)，72℃1min，此程序進(jìn)行13個(gè)循環(huán)，然后在94℃：30s，56℃：30s，72℃：1min下進(jìn)行26個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。

8、4、SSAP技術(shù)是基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)。在擴(kuò)增時(shí)需要一個(gè)在反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子上的特異性引物，所以知道反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的序列或者其上的保守序列是必須的。我們的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和相同的限制性內(nèi)切酶的引物相組合得到條帶的數(shù)目和多態(tài)性有著明顯的差別，這就要求必須要有足夠多的特異性引物來(lái)選擇。同時(shí)由于不同特異性引物的GC含量不同，所以對(duì)于不同的特異性引物需要探究它們合適的退火溫度。SSAP技術(shù)似乎在重復(fù)性方面不如AFLP，但其多