SPR生物傳感器用于檢測兩種禽類病毒和轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1Ab的研究.pdf

1、J亞群禽白血病病毒(ALV-J)和H9N2亞型禽流感病毒（H9N2 AIV）是兩種嚴重危害世界各國包括我國的養(yǎng)禽業(yè)，并對其造成巨大經(jīng)濟損失的禽類病毒。目前這兩種病毒的傳統(tǒng)檢測方法大都存在處理周期長、成本高，有時檢測結(jié)果易出現(xiàn)假陽性等缺點。另外，轉(zhuǎn)基因作物的大量種植造成了生態(tài)系統(tǒng)方面的擔憂，轉(zhuǎn)基因食品對人類的健康是否具有危害也存在較大爭議。而當前現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因蛋白的檢測技術(shù)存在著操作復(fù)雜、耗時較長、成本高、重現(xiàn)性和準確性差的缺點。因此，本文

2、將采用具有免標記樣品、實時在線監(jiān)測、靈敏快速檢測的突出特點的表面等離子體共振(SPR)生物傳感器檢測這兩種禽類病毒和轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1Ab。同時為了提高構(gòu)建的SPR生物傳感器的靈敏度，使檢測結(jié)果更準確，Au/Ag復(fù)合納米粒子和三角Ag納米片作為增敏材料被引入傳感器中。本文包括以下三部分實驗內(nèi)容。
　　(1)實驗構(gòu)建了兩種SPR生物傳感器——傳統(tǒng)模式生物傳感器和Au/Ag復(fù)合納米粒子增敏的生物傳感器用于檢測ALV-J。前者借助Au-

3、S鍵使3-巰基丙酸(MPA)在SPR裸金膜芯片上形成一層密集的自組裝單分子層，通過氨基與MPA中被活化劑活化后的羧基結(jié)合使蛋白A修飾到芯片上，接著芯片被乙醇胺滅活后，ALV-J抗體的非抗原結(jié)合位點與蛋白A結(jié)合使抗體修飾到芯片上，最后實現(xiàn)了對ALV-J抗原的檢測;后者借助Au-S鍵使1，6-己二硫醇(HDT)一端在裸芯片上形成一層密集的自組裝單分子層，另一端借助Au-S鍵、Ag-S鍵使Au/Ag復(fù)合納米粒子修飾到芯片上，接下來傳感器修飾各

4、種物質(zhì)與檢測的方法同前者。結(jié)果兩種傳感器均能成功檢測ALV-J抗原，檢測限分別是1054 TCID50·mL-1和659 TCID50·mL-1，說明將Au/Ag復(fù)合納米粒子引入SPR生物傳感器中可有效提高傳感器的靈敏度。而且進行的對比實驗展現(xiàn)了制備的傳感器具有良好的特異性。
　　(2)實驗構(gòu)建了一種新型的SPR生物傳感器用于檢測H9N2 AIV。首先借助HDT將三角Ag納米片修飾到芯片上，然后依次在芯片上修飾MPA、蛋白A和兔抗

5、H9N2單克隆抗體，并最終實現(xiàn)對H9N2 AIV及裂解AIV的檢測。結(jié)果傳感器能順利檢測完整的H9N2 AIV，最低檢測濃度為103 ELD50·mL-1。裂解病毒的濃度在50～103 ELD50·mL-1范圍內(nèi)與SPR信號成線性關(guān)系，檢測限為28 ELD50·mL-1(S/N=3)。另外，此SPR生物傳感器還展現(xiàn)了良好的檢測特異性。
　　(3)實驗構(gòu)建了兩種SPR生物傳感器（傳感器1和傳感器2）用于檢測轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1Ab。在

6、傳感器2的芯片上依次修飾HDT、Au/Ag復(fù)合納米粒子、MPA、蛋白A和鼠抗Cry1Ab單克隆抗體，從而實現(xiàn)對C巧1Ab蛋白的檢測。傳感器1與傳感器2的構(gòu)建過程相比，不同點在于沒有先固定蛋白A而直接固定抗體。結(jié)果這兩種傳感器分別在Cry1Ab蛋白的濃度為10～500 ng·mL-1和8～1000 ng·mL-1時有良好的線性響應(yīng)，檢測限分別為5.0 ng·mL-1和4.8 ng·mL-1(S/N=3)。同時兩種生物傳感器均具有較高的特異