對氯苯丙氨酸抑制野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓和肺組織炎癥反應及機制研究.pdf

1、肺動脈高壓（Pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種復雜的病理生理過程，包括肺血管重構、收縮及肺組織炎癥反應。它的特點是肺血管壓力持續(xù)性、進行性的升高，肺血管重塑，最終導致右心衰竭甚至死亡。許多血管活性物質，包括5-羥色胺（serotonin，5-HT），血小板生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，白介素(interleukin，IL)，內皮素-1（en

2、dothelin-1，ET-1）等參與PAH的病理過程。
　　肺血管重構的原因主要包括肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smoothmuscle cells，PASMCs)增殖和肥大，周圍非肌型小動脈肌化，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)降解。ECM不只具有連接、支持、保水、抗壓及保護等物理學作用，對細胞的基本生命活動發(fā)揮重要的生物學作用，影響細胞的生長、增殖、遷移、分化、死亡等

3、。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類鋅、鈣等金屬離子依賴性的多肽家族，它幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分。我們先前研究表明，野百合堿(monocrotoline，MCT)誘導的大鼠PAH模型中，MMP-2和MMP-9水平明顯增高。MMPs的高表達能促進細胞遷移和增殖?；|金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors ofmetalloproteinases，TIMPs)調節(jié)MMP

4、s家族的水解活性，調節(jié)其發(fā)揮正常功能，兩者共同維護ECM的穩(wěn)態(tài)。
　　炎癥機制與PAH發(fā)生發(fā)展密切相關。研究發(fā)現(xiàn)PAH患者血管周圍大量炎性細胞如巨噬細胞、淋巴細胞、肥大細胞等聚集，浸潤;結締組織病等一些炎癥性疾病能增加PAH發(fā)病率。在缺氧和MCT誘導的PAH模型中，IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、細胞粘附分子(intercellular adhesionmolecu

5、le-1, ICAM-1)表達明顯增多。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，MCT誘導的大鼠PAH模型中，炎性細胞因子IL-1β、TNF-α、單核細胞趨化蛋白(monocytechemoattractant protein-1，MCP-1)等表達增加。
　　5-HT作為一種內源性血管活性物質，通過與5-羥色胺受體(serotonin receptor,5-HTR)結合或經5-羥色胺轉運體(serotonin transporter, SERT

6、)進入血管平滑肌細胞引起血管收縮、細胞增殖及局部微血栓的形成，5-HT與PAH的形成發(fā)展密切相關。SERT是一種膜蛋白，研究發(fā)現(xiàn)SERT可能參與PAH的肺血管重構和肺組織炎癥反應。SERT可以調節(jié)5-HT“內在化”引起PASMCs的有絲分裂和促有絲分裂。色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，Tph)是影響5-HT合成關鍵限速酶。調節(jié)5-HT合成的Tph包括兩種類型Tph-1和Tph-2。Tph-1主要存在于腸嗜鉻細

7、胞和腎，影響外周器官5-HT的合成。Tph-2主要存在于腦干和腸系膜神經細胞，影響中樞神經系統(tǒng)5-HT合成。特發(fā)性肺動脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）患者肺血管內皮細胞5-HT合成和Tph-1表達增多。
　　對氯苯丙氨酸(p-chlorophenylalanine，PCPA)是一種色氨酸羥化酶抑制劑。PCPA能降低MCT誘導的大鼠右心室肥大。然而，我們不清楚色

8、氨酸羥化酶抑制劑是否能抑制MCT誘導的肺血管重構和肺組織炎癥。因此，本實驗針對PCPA抑制PAH的機制進行研究，探討PCPA對MCT誘導的大鼠PAH肺血管重構和肺組織炎癥反應的作用，為臨床研究PAH新的治療靶點提供理論依據(jù)。
　　實驗材料與方法：
　　建立MCT誘導的慢性炎性肺動脈高壓大鼠模型:把68只雄性SD大鼠隨機分為4組，(i)對照組、(ii) MCT組、(iii) PCPA低劑量組(MCT+P1)，MCT+50mg·

9、kg-1 PCPA，和(iv) PCPA高劑量組(MCT+P2)，MCT+100 mg·kg-1 PCPA;MCT組、PCPA低劑量組和PCPA高劑量組給大鼠一次性腹腔內注射MCT60mg·kg-1;注射后，PCPA低劑量組和PCPA高劑量組分別給大鼠皮下注射給予PCPA50 mg·kg-1·d-1和100 mg·kg-1·d-1，給藥21天。第22天，檢測血液動力學、右心肥厚指數(shù)等指標;用病理染色的方法檢測肺小動脈血管壁的改變與肺組織

10、炎癥;用Western Blot方法檢測Tph-1、SERT、MMP-2/-9、TIMP-1/-2、IL-1β、TNF-α、ICAM-1的表達;用免疫組化方法檢測Tph-1、SERT的表達;用明膠酶譜方法檢測MMP-2、MMP-9的活性;用統(tǒng)計分析的方法，分別比較以上不同組別之間各項指標的差異，探討PCPA對抗MCT誘導的大鼠肺動脈高壓機制。
　　實驗結果：
　　1、PCPA抑制MCT誘導的肺動脈高壓大鼠肺動脈壓力和右心室肥

11、厚指數(shù)
　　成功建立慢性炎性肺動脈高壓大鼠模型。與對照組比較，MCT組中大鼠的平均肺動脈壓顯著升高，體重減低，PCPA組顯著降低了MCT誘導的肺動脈壓力。與對照組相比，MCT組中大鼠右心肥厚指數(shù)明顯增加，而PCPA明顯降低右心指數(shù)，抑制了MCT誘導的右心室肥厚。但四組平均動脈收縮壓沒有顯著差別。
　　2、PCPA劑量依賴性地抑制肺動脈重構
　　MCT組肺動脈血管壁厚度比對照組明顯增厚，PCPA劑量依賴性地抑制了肺動脈血

12、管壁增厚。MCT組肺動脈血管壁面積與對照組相比明顯增加，PCPA明顯減少肺動脈血管壁面積。這些結果表明PCPA劑量依賴性地抑制MCT誘導的大鼠肺動脈重構。
　　3、PCPA抑制肺組織Tph-1蛋白表達
　　免疫組化和Western Blot實驗結果表明，MCT誘導的大鼠肺組織Tph-1表達顯著增加，PCPA劑量依賴性地降低了Tph-1的過度表達。
　　4、PCPA降低肺組織SERT蛋白表達
　　免疫組化和West

13、ern Blot實驗評估SERT的表達。結果顯示MCT組大鼠肺組織中SERT表達顯著增加，PCPA劑量依賴性降低MCT誘導增加的SERT。
　　5、PCPA抑制肺組織中MMP-2/-9的活性及MMP/TIMP的蛋白表達
　　明膠酶譜實驗評估MMP-2和MMP-9的活性。MCT組大鼠肺組織中的MMP-2，MMP-9活性顯著增加，PCPA高劑量組中，MCT誘導的MMP-2，MMP-9的活性降低。
　　Western Blo

14、t結果表明，MCT組肺組織中的MMP-2/-9，TIMP-1/-2蛋白表達顯著增加，PCPA劑量依賴性的降低MMP-2/-9，TIMP-1/-2的表達。
　　6、PCPA抑制肺動脈周圍和肺組織炎癥
　　與對照組相比，MCT組大鼠肺組織結構不清晰，血管周圍和肺組織中有大量炎性細胞浸潤。PCPA低劑量對血管周圍及肺組織炎性細胞改善不明顯。PCPA高劑量顯著減少血管周圍炎性細胞，改善肺組織結構。
　　7、PCPA抑制MCT誘

15、導的肺組織IL-1β、TNF-α、ICAM-1蛋白表達水平
　　MCT組大鼠肺組織中的IL-1β、TNF-α、ICAM-1表達明顯增高，PCPA顯著減少MCT誘導IL-1β、TNF-α、ICAM-1的蛋白表達。
　　結論：
　　1、PCPA降低MCT誘導的肺動脈壓力，緩解肺動脈重構及改善右心肥厚，說明PCPA有效抑制MCT誘導的大鼠PAH。PCPA抑制MCT誘導的大鼠肺組織中Tph-1和SERT表達，說明PCPA抑制P