OSW-1在microRNA-122對肝癌細胞基因及Wnt信號通路作用中的研究.pdf

1、目的：①建立高表達microRNA-122的肝癌細胞模型，研究microRNA-122對肝癌細胞的影響及OSW-1對此細胞模型的作用影響。
　　②研究OSW-1對肝癌細胞microRNA水平的影響。
　?、厶剿鱋SW-1在過表達microRN A-122的Hep3B-miR-122肝癌細胞的凋亡和增殖活性、基因表達譜和Wnt信號通路相關(guān)基因調(diào)控表達的影響。
　?、苎芯縊SW-1的抗腫瘤機制和進一步揭示microRNA-

2、122的生物學(xué)功能并尋找OSW-1的靶向作用基因。
　　方法：①體外建造含有microRNA-122前體序列的重組質(zhì)粒pSIREN-miR-122，并將其成功轉(zhuǎn)染入Hep3B細胞中，篩選出穩(wěn)定高表達microRNA-122的單克隆細胞株，并使用熒光實時定量PCR和雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證構(gòu)建的細胞株。
　?、趯ep3B細胞分設(shè)成4組：(A)陰性對照組;(B)OSW-1組；(C)阿霉素組；(D)OSW-1與阿霉素聯(lián)合用藥組。利

3、用LNATM microRNA微陣列芯片技術(shù)檢測這四組的人類全microRNA基因組的表達情況。
　?、蹖⒎€(wěn)定高表達microRNA-122的Hep3B-miR-122細胞分設(shè)2組：(A)陰性對照組；(B)OSW-1組。使用Roche-NimbleGen全基因組表達譜芯片檢測全基因的表達，并通過GO分析和patway分析其具體的表達情況。
　?、芡ㄟ^WST-8法Cell Counting Ki-8檢測試劑細胞增殖和毒性檢測，

4、繪制Hep3B細胞和Hep3B-miR-122細胞的生長曲線和在OSW-1和阿霉素等作用下的凋亡曲線。
　?、萃ㄟ^投射電鏡和共聚焦顯微鏡技術(shù)對Hep3B細胞和Hep3B-miR-122與經(jīng)過OSW-1作用后的兩組細胞進行比對，觀察其形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果：①成功構(gòu)建了pSIREN-miR-122重組質(zhì)粒和穩(wěn)定高表達microRNA-122的Hep3B-miR-122單克隆細胞株。
　?、贠SW-1作用于 Hep3B細胞

5、后，hsa-mir-299–5p、has-miR-1908、has-miR-125b-1-3p、has-miR-187a-5p、has-miR-1275、hav1-miR-H6-3p、ebv-miR-BHRF1-2、has-miR-181a-5p、has-miR-210、has-mir-483-3P等表達上調(diào)；hsa-miR-126-3p和hsa-miR-208a等表達下調(diào)。OSW-1在阿霉素的聯(lián)合作用下使得Hep3B細胞中的has-m

6、iR-142-3p、miR-200c-3p等表達上調(diào)。以上microRNA與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲力和轉(zhuǎn)移性有密切聯(lián)系。
　?、跲SW-1可影響MAPK、WNT、Hedegehog、AXON、VEGF、FOCAL、Adhere ns Junctio n、P53等通路中的眾多基因的表達，其中包括Ras、c-JUN、c-Myc、CyclinD和Bcl-2等癌基因和CytC、Caspase-3、8、9等抑癌基因。
　?、蹾ep3B

7、-miR-122組的增殖速率低于Hep3B組（P<0.01）。OSW-1和阿霉素可抑制Hep3B細胞的增殖，Hep3B-miR-122較Hep3B相比其受腫瘤藥物的抑制作用更加明顯。⑤microRNA-122可使細胞核質(zhì)比增大，線粒體增大，線粒體脊結(jié)構(gòu)消失，OSW-1使細胞和線粒體固縮。
　　結(jié)論：①OSW-1可以調(diào)節(jié)眾多與增殖分化、凋亡、細胞粘附、侵襲力等相關(guān)microRNA的表達。②OSW-1可以抑制腫瘤細胞的增殖速率，促進凋