新城疫病毒7793和D817株對人結(jié)腸癌的抑制作用.pdf

1、背景和目的：新城疫病毒(newcastle desease virus，NDV)屬副黏病毒科Avulavirus屬，為單股負(fù)鏈RNA病毒。NDV主要感染禽類致病，只在極少數(shù)的情況下感染人類，且為自限性疾病。通常情況下NDV對人類是無毒的，目前已作為藥物治療的一種補(bǔ)充和替代療法(complementary and altemative medicine，CAM)，得到廣泛的研究。 19世紀(jì)50年代，一位匈牙利科學(xué)家發(fā)現(xiàn)農(nóng)場主因感染

2、了NDV而使其所患的晚期胃癌的轉(zhuǎn)移受到抑制，這個現(xiàn)象引起了這位科學(xué)家的關(guān)注以及眾多學(xué)者對NDV的研究興趣。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，NDV能選擇性殺傷人類腫瘤細(xì)胞，且不依賴于腫瘤細(xì)胞增殖而獨(dú)立復(fù)制，在人類腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制效率是在正常細(xì)胞中的10000倍，這使其成為潛在的抗癌生物因子。已有的研究結(jié)果表明，NDV溶瘤譜廣且不良反應(yīng)輕微，不同的NDV株系其抗腫瘤譜及抗腫瘤效果也不盡相同。近年來國外有部分NDV毒株如NDV-HUJ、NDV-73T、MTH

3、68、PV701等已進(jìn)入II、III期臨床實驗，部分實驗結(jié)果顯示NDV在臨床腫瘤治療方面具有良好應(yīng)用前景。而國內(nèi)對NDV的研究還比較少，主要集中在NDV疫苗弱毒株La Sota上。本研究小組以科室豐富的病毒來源為基礎(chǔ)，篩選到兩株特異性更強(qiáng)、效用更好的抗腫瘤新城疫野生毒株。本試驗就這兩株病毒對人結(jié)腸癌體內(nèi)外的抑制作用進(jìn)行了初步探討。 材料和方法： 1.病毒的純化：將新城疫病毒DK/HK/817/1980和WDK/JX/77

4、93/2004(分別簡稱NDV D817、NDV7793，均為野生毒株，由香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系管軼教授惠贈)接種SPF級雞胚擴(kuò)增病毒，48h后收取雞胚尿囊液。測定HA滴度≥1:2048后，用Vero-E6細(xì)胞連續(xù)3次作蝕斑純化，得到的純化病毒經(jīng)SPF級雞胚再次擴(kuò)增后，收集保存于-80℃冰箱。 2.體外實驗部分：選取人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、Ls174t(購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)和人原代正常結(jié)腸細(xì)胞作為實驗對象，

5、通過蝕斑實驗測定兩株純化病毒的蝕斑形成單位(plaque forming unit，PFU)來判斷病毒的感染力；用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)微量釋放法測定病毒對人結(jié)腸癌細(xì)胞和正常人結(jié)腸組織細(xì)胞的殺傷效用；用血凝實驗測定病毒在不同細(xì)胞中的血凝素(hemagglutin，HA)滴度，從而判斷病毒在其中的增殖力。 3.體內(nèi)實驗部分：根據(jù)體外試驗結(jié)果，選取病毒比較敏感的LoVo細(xì)胞株，以1×107個

6、細(xì)胞/0.2mL劑量，皮下接種于裸小鼠右側(cè)腋窩建立人結(jié)腸癌裸小鼠移植瘤模型。接種7天后明顯成瘤，成功率為100％。10天后，腫瘤長、寬徑分別達(dá)到5mm，去除形態(tài)、大小差異大的荷瘤小鼠，將剩余荷瘤小鼠按瘤體積配對原則隨機(jī)分成8組，每組6只。分別為PBS組；5-FU組；NDV7793和NDV D817各高、中、低三種劑量組。各組行瘤內(nèi)瘤周多點(diǎn)少量注射，0.1mL/只，每周一次，共3周；停藥后，繼續(xù)觀察4周。從第一次注射開始，每天觀察小鼠的活

7、動、精神狀況以及移植瘤生長狀況、腫瘤有無紅腫、破潰。常規(guī)測量腫瘤長徑、寬徑以及體重，每3天1次。7周后將裸小鼠處死、解剖并取材，進(jìn)行以下檢測： ①繪制腫瘤生長曲線，并將瘤塊剝離、稱重，計算腫瘤抑制率；對瘤組織進(jìn)行切片、HE染色，倒置顯微鏡下觀察病理結(jié)構(gòu)。 ②計算荷瘤小鼠試驗前后體重變化；解剖過程中觀察荷瘤細(xì)胞肝臟外觀，并將肝組織切片、HE染色觀察肝細(xì)胞的損傷程度。 ③電鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)檢測癌細(xì)胞凋

8、亡率和壞死率；細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C(cytochromes C，Cyt-C)的檢測；免疫組織化學(xué)染色觀察Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的變化。 ④血凝實驗檢測荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤組織及其他正常組織內(nèi)NDV活病毒，以判斷生物治療的安全性。 4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計：實驗結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，用F檢驗比較組間差異的顯著性，數(shù)據(jù)均以-X±s表示。 結(jié)果： 1.體外實驗結(jié)果 1.1蝕斑試驗中，NDV

9、7793出現(xiàn)蝕斑的時間較晚，直徑較小，PFU為1.25×107，毒性較弱；D817出現(xiàn)蝕斑的時間較早，直徑較大，PFU為5.52×107，毒性較強(qiáng)。 1.2 NDV D817、NDV7793對LoVo細(xì)胞株更敏感；NDV7793對兩株人結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)于NDV D817株；且不同NDV毒株對不同癌細(xì)胞的最大殺傷效應(yīng)與最佳作用時間、最適作用濃度具有相關(guān)性。 1.3 NDV D817、NDV7793均可以在腫瘤細(xì)胞中生

10、長復(fù)制；兩株病毒在人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo的復(fù)制能力強(qiáng)于Ls174t; NDV7793在人結(jié)腸癌細(xì)胞的復(fù)制能力強(qiáng)于NDV D817。 1.4 NDV D817株具有膜融合性，符合溶瘤細(xì)胞株的特性；NDV7793株則無。符合先前研究中對NDV D817為溶瘤細(xì)胞株、NDV7793為非溶瘤株的推斷。 1.5 NDV D817、NDV7793均不能在正常人結(jié)腸細(xì)胞中的復(fù)制；且對其沒有明顯殺傷作用。 2.體內(nèi)實驗結(jié)果

11、 2.1從腫瘤生長曲線圖可觀察到，5-FU組，NDV7793高、中劑量組和NDVD817中劑量組荷瘤小鼠腫瘤生長較緩慢。荷瘤小鼠瘤塊稱重后計算腫瘤抑制率，5-FU組為37.14％(P<0.01)，NDV7793高、中劑量組和NDV D817中劑量組的腫瘤抑制率分別達(dá)到50.14％(P<0.01)，37.86％(P<0.01)和47.98％(P<0101)；此外，NDV7793抑瘤作用呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。 2.2停藥后1周，可

12、以明顯觀察到5-FU組較以上三組腫瘤生長更迅速。 2.3實驗結(jié)束后，NDV7793高劑量組體重較PBS組高，其他各組較PBS組有不同程度的下降(P<0.05)。 2.4肉眼觀察各組荷瘤小鼠肝臟外觀無異常，切片中無轉(zhuǎn)移灶，但均有一定程度的損傷。其中5-FU的毒副作用最大，此小組有1/3荷瘤小鼠出現(xiàn)肝組織脂肪變性。 2.55-FU引起癌細(xì)胞死亡方式主要是壞死；NDV7793高劑量和NDV D817中劑量均可明顯提高癌

13、細(xì)胞的凋亡率(P<0.01)。 2.6 NDV7793高劑量和NDV D817中劑量均可明顯的增強(qiáng)線粒體膜的通透性，提高細(xì)胞質(zhì)中Cyt-C含量。 2.7與5-FU組相比，NDV7793高劑量組和NDV D817中劑量組癌細(xì)胞的Bax蛋白表達(dá)最強(qiáng)；而Bcl-2蛋白表達(dá)各組之間無顯著差異。 2.8在荷瘤小鼠體內(nèi)，NDV7793和NDV D817均可以局限在腫瘤組織中復(fù)制增殖，符合生物安全性。 結(jié)論：

14、1.本實驗進(jìn)一步驗證了NDV7793為弱毒株，非溶瘤株；NDV D817為強(qiáng)毒株，溶瘤株這一結(jié)果。 2.DK/HK/817/1980株NDV和WDK/JX/7793/2004株NDV均具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤效應(yīng)，且最佳抑制作用和最適作用劑量相關(guān)。 3.DK/HK/817/1980株NDV和WDK/JX/7793/2004株NDV的抗人結(jié)腸癌的作用機(jī)制除了可以選擇性在癌細(xì)胞中復(fù)制增殖外，還可能與最適劑量的NDV毒株上調(diào)Ba