桃ATP-ADP PpIPT基因鑒定與表達分析.pdf

1、ATP/ADP異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(ATP/ADP IPT)是植物細胞分裂素從頭合成的關(guān)鍵酶。本試驗以桃（Prunus persica）為試材，利用已經(jīng)公布的桃全基因組數(shù)據(jù)，鑒定了桃樹ATP/ADP PpIPT基因家族的4個成員。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，驗證了各ATP/ADPPpIPTs基因在細胞分裂素合成及調(diào)控植物生長發(fā)育中的功能。利用熒光定量技術(shù)，全面分析了桃樹根、葉及果實中ATP/ADP PpIPTs基因?qū)ν庠床煌盘柡图に匦盘柕捻憫?yīng)特性。分

2、析了桃樹枝條頂端優(yōu)勢過程中，ATP/ADP PpIPTs基因的表達特性以及生長素、細胞分裂素和獨腳金內(nèi)酯間的相互作用。檢測了魯星油桃果實生長發(fā)育全過程中，果實果肉和種子內(nèi)源細胞分裂素含量及ATP/ADP PpIPTs基因表達量的動態(tài)變化。主要研究結(jié)果如下:
　　1.桃ATP/ADP PpIPTs基因家族成員鑒定及其功能驗證
　　GDR預(yù)測的桃ATP/ADP PpIPT基因家族共有5個成員，通過驗證，在桃樹中實際表達的是4個基

3、因，分別命名為PpIPT1、PpIPT3、PpIPT5a和PpIPT5b，各成員均無內(nèi)含子，N端均具有保守結(jié)構(gòu)域序列。生物信息學(xué)分析軟件分析結(jié)果顯示:各成員啟動子區(qū)域都含有大量的順式作用元件，反映其表達可能響應(yīng)植物體內(nèi)外的多種信號，調(diào)控細胞分裂素合成。各成員的亞細胞定位和組織表達特性呈現(xiàn)明顯的多樣性，說明它們分別參與了不同的生長發(fā)育調(diào)控過程。過量表達ATP/ADP PpIPTs的轉(zhuǎn)基因擬南芥的細胞分裂素含量明顯高于野生型，其生長發(fā)育和抗

4、鹽能力也明顯與野生型不同;各成員過量表達后，轉(zhuǎn)基因擬南芥呈現(xiàn)相似的表型。以過量表達pIPT5a的擬南芥為例，與野生型擬南芥相比，其葉片數(shù)量和葉綠素含量顯著高于野生型，主根發(fā)育明顯強于野生型;高鹽脅迫下，過量表達PpIPT5a的擬南芥的生長明顯比野生型好，顯著提高了其抗鹽能力。
　　2.桃果實生長發(fā)育過程中果肉和種子細胞分裂素和ATP/ADP PpIPTs基因表達的動態(tài)變化
　　果肉中ATP/ADP PpIPTs基因的表達量在

5、花后兩周內(nèi)迅速下降，之后一直維持在很低的水平，而此時果肉中細胞分裂素含量很高，說明果實發(fā)育前期果肉細胞分裂所需要的細胞分裂素可能并不完全來源于自身合成。種子中PpIPT1、3、5b的表達水平在花后也很低，而PpIPT5a的表達量在花后兩周迅速升高，這與細胞分裂素含量在幼果期迅速升高的趨勢相一致，同時PpIPT5a在種子中的表達量明顯高于其他部位，因此pIPT5a是果實前期自身合成細胞分裂素的關(guān)鍵基因。外源細胞分裂素處理后，細胞分裂素的三

6、個受體中PpHK3和PpHK4的表達量明顯升高，是果實細胞分裂素信號傳遞的關(guān)鍵受體。桃果實生長發(fā)育過程中，果肉和種子中細胞分裂素含量的變化規(guī)律顯示:tZ和iP型細胞分裂素含量在第一次快速生長期出現(xiàn)最大高峰，而在第二次快速生長期一直保持較低水平，說明細胞分裂素主要在果實的第一次快速生長期促進細胞分裂。我們還發(fā)現(xiàn)在硬核期果肉中tZ出現(xiàn)了第二個高峰，同時硬核前期外源tZ處理能夠顯著提高內(nèi)果皮POD酶的活性，有利于木質(zhì)素單體聚合形成木質(zhì)素。

7、r>　　3.桃樹氮代謝與細胞分裂素的互作
　　外源供應(yīng)無機氮，桃樹能夠快速響應(yīng)硝酸鹽信號，ATP/ADP PpIPTs基因表達上調(diào)，細胞分裂素合成增加。其中PpIPT3基因是桃樹中快速響應(yīng)硝酸鹽信號的關(guān)鍵基因，能夠在外源硝酸鹽處理后2小時內(nèi)表達量迅速上升。不同的氮代謝抑制劑預(yù)處理并不能夠抑制PpIPT3基因?qū)ν庠聪跛猁}處理的響應(yīng)，說明進入細胞的硝酸根離子是誘導(dǎo)PpIPT3基因表達迅速上升的直接信號分子。外源細胞分裂素處理對根和枝條

8、內(nèi)氮代謝有重要影響，在根中，外源細胞分裂素處理能夠抑制根系吸收硝酸根離子，促進根內(nèi)硝酸根離子的同化和外運。外源細胞分裂素處理能夠影響葉片中氮代謝相關(guān)基因的表達，不同部位不同葉齡葉片內(nèi)氮代謝相關(guān)基因表達的受調(diào)控情況不同。N同位素標(biāo)記顯示，外源細胞分裂素處理能夠促進葉片吸收葉施氮素，并促進N素向枝條的生物學(xué)下端分配。
　　4.桃樹不同部位ATP/ADP PpIPTs基因?qū)ν庠床煌に靥幚淼捻憫?yīng)特性
　　ATP/ADP PpIPT

9、s基因?qū)に靥幚眄憫?yīng)呈現(xiàn)顯著器官差異。外源細胞分裂素處理能夠顯著抑制根和葉片中ATP/ADP PpIPTs基因的表達，各成員在根和葉片中對外源細胞分裂素處理響應(yīng)敏感程度不同。與根和葉片中不同，外源細胞分裂素處理并不能夠抑制果實中ATP/ADP PpIPTs基因的表達，相反，外源細胞分裂素處理還能夠不同程度的誘導(dǎo)果肉和種子中ATP/ADP PpIPTs基因的表達。說明在桃樹根和葉片中存在ATP/ADP PpIPTs基因介導(dǎo)的細胞分裂素合成

10、的自身反饋抑制調(diào)節(jié)，而桃果實中沒有。桃樹中ATP/ADPPpIPTs基因?qū)τ谕庠雌渌参锛に靥幚硪渤尸F(xiàn)出顯著地器官差異。
　　5.桃樹枝條頂端優(yōu)勢中ATP/ADP PpIPTs基因的表達特性及激素調(diào)控
　　新梢摘心后，枝條側(cè)芽部位節(jié)內(nèi)ATP/ADP PpIPTs基因（PpIPT1、PpIPT3和PpIPT5a）的表達量迅速上升，與摘心后側(cè)芽部位節(jié)和側(cè)芽內(nèi)細胞分裂素含量的上升相一致。摘心后側(cè)芽部位節(jié)內(nèi)ATP/ADP PpIPT

11、s基因表達上升引起側(cè)芽部位細胞分裂素含量的升高對于促進側(cè)芽生長是必須的。生長素能夠直接抑制側(cè)芽部位節(jié)內(nèi)ATP/ADP PpIPTs基因的表達，抑制側(cè)芽的生長。與生長素不同，摘心后獨腳金內(nèi)酯處理沒有抑制側(cè)芽部位節(jié)內(nèi)ATP/ADP PpIPTs基因表達的上升，但是會降低其上升速度。進一步研究發(fā)現(xiàn)獨腳金內(nèi)酯不能夠單獨抑制側(cè)芽的生長，其發(fā)揮作用依賴于生長素的存在。獨腳金內(nèi)酯能夠通過控制側(cè)芽部位節(jié)內(nèi)PpPIN1基因的表達，控制桃樹枝條內(nèi)生長素的極