豬溶素誘導宿主產(chǎn)生炎癥因子的分子機制研究.pdf

1、豬鏈球菌可以引起豬腦膜炎,是世界公認可引起動物傳染病的重要病原體。作為一種人畜共患病病原菌,豬鏈球菌感染人類的散發(fā)病例(主要是腦膜炎)在過去的四十五年已有報道。在2005年,中國報道超過200人感染豬鏈球菌,病死率高達20％。死亡病例表現(xiàn)為罕見的中毒性休克樣綜合征(TSLS),而且這類病人血清中細胞因子(IL-1β,IL-6,IL-8,IL-12p70,IFN-γ和TNF-α)水平明顯高于臨床表現(xiàn)為單純腦膜炎的病人。這些細胞因子的過量釋

2、放可能是引起TSLS的重要原因。
　　眾多國外學者發(fā)現(xiàn),歐洲的豬鏈球菌致病株31533經(jīng)過熱滅活性后,可以激活人類單核細胞系THP-1以及小鼠巨噬細胞系J774A1和P388D1,釋放大量的細胞因子。細菌的細胞壁成分及其毒力因子豬溶素(SLY)可以激活內皮細胞釋放細胞因子。純化的重組SLY蛋白可以刺激人單核細胞釋放TNF-α,也可以刺激豬PAMs釋放IL-6。
　　在中國引起暴發(fā)流行的豬鏈球菌為ST7型,與歐洲流行株ST1型

3、相比,ST7型對人外周血單個核細胞(PBMC)的毒性較強;而且SLY蛋白在我國的ST7型菌株中表達量高于ST1型,是重要的毒力因子。本研究通過毒力基因篩選,發(fā)現(xiàn)SLY是中國流行株中引起宿主產(chǎn)生炎癥因子的重要毒力蛋白。SLY由497個氨基酸殘基組成,歸屬于依賴膽固醇的細胞溶素(CDC)家族;CDC家族目前具有23個成員,包括產(chǎn)氣莢膜梭菌釋放的外毒素(PFO),以及化膿性鏈球菌釋放的外毒素(SLO)。CDC家族所有成員都是由革蘭氏陽性菌釋放

4、的一種外毒素,他們共同的特征是可以在富含膽固醇的細胞膜上打孔從而引起細胞通透性改變或者導致細胞裂解。據(jù)報道,SLY可以在人紅細胞表面打孔,形成直徑約為7nm的小孔,從而引起紅細胞裂解,即我們通常所說的溶血。
　　以2005年分離的中國豬鏈球菌致病株05ZY為模板,本室構建了多株毒力基因缺失突變株。本研究首先通過構建細胞模型,對缺失突變株進行篩選,實驗結果表明野生菌株05ZY可以誘導內皮細胞產(chǎn)生炎癥因子,sly基因敲除后,不能誘導內

5、皮細胞產(chǎn)生炎癥因子。緊接著,對其編碼的蛋白進行純化和鑒定;深入研究了SLY蛋白誘導細胞產(chǎn)生炎癥因子的機制。
　　隨后,選用了PBMC、THP-1MΦ、RAW264.7和小鼠腹腔分離的原代巨噬細胞為細胞模型,對SLY的作用進行深入研究。實驗結果表明PBMC對SLY蛋白敏感性強于巨噬細胞,具體表現(xiàn)為低濃度的SLY即可誘導PBMC產(chǎn)生高濃度TNF-α。由于細胞碎片也可以誘導細胞產(chǎn)生炎癥因子,本研究還構建了重組SLY蛋白(rSLY)以及完

6、全缺失溶血活性的點突變蛋白(P353V),進一步研究SLY的作用是否依賴其溶血活性。實驗結果表明SLY的作用不依賴其溶血活性,很可能是被宿主重要模式識別受體識別,從而導致炎癥因子的釋放。
　　國內外學者通過體內和體外實驗,均證明了SLY可以誘導宿主產(chǎn)生炎癥因子,但是卻沒有進一步的深入研究其機制。作者通過文獻調研,發(fā)現(xiàn)同家族的PLY(肺炎鏈球菌分泌的外毒素)誘導巨噬細胞產(chǎn)生炎癥因子通過TLR4受體發(fā)揮作用。SLY是否與PLY有相似的

7、作用值得進一步研究。本研究應用了多種受體抑制劑,結果發(fā)現(xiàn)TLR4特異性抑制劑可以完全抑制SLY對多種細胞的作用,推測SLY的作用很可能依賴于TLR4受體。緊接著,本研究引入了TLR4點突變小鼠,結果顯示,SLY誘導細胞產(chǎn)生炎癥因子依賴于TLR4受體。
　　隨后,應用MyD88、TRIF以及MAPKs特異性抑制劑來分析SLY-TLR4的下游信號通路。結果顯示,MyD88是SLY發(fā)揮作用的重要胞內接頭蛋白分子。而p38-MAPK抑制劑

8、可以完全抑制SLY對PBMCs的作用。應用westernblot檢測技術來分析SLY對細胞MAPKs的直接激活情況,結果表明SLY在短時間內即可直接激活PBMCs細胞內的p38-MAPK分子。最后利用熒光素報告基因檢測技術來研究SLY對轉錄因子的激活作用,結果表明SLY可以激活轉錄因子NF-κB。NF-κB激活后從胞漿內進入細胞核,從而調控炎癥因子的表達。
　　雖然有報道稱熱滅活的歐洲菌株31533可以激活單核巨噬細胞釋放多種炎癥

9、因子。但是細菌的濃度必須達到109cfu/ml才可以誘導細胞產(chǎn)生高水平的炎癥因子,當細菌濃度降至108cfu/ml時,TNF的水平很快降落下來。TNF是最早被檢測的細胞因子,其動力學分析顯示,其水平可于5小時內迅速降至基線水平。而國外學者從31533提取的細胞壁成分,濃度高達150ug/ml才可以誘導THP-1MΦ細胞產(chǎn)生TNF-α,本研究應用SLY濃度為100ng/ml時激活THP-1MΦ產(chǎn)生TNF-α水平與其相當。值得一提的是,12

10、.5ng/ml的SLY蛋白即可誘導PBMCs產(chǎn)生大量TNF-α,并且此效應可以持續(xù)長達36小時。
　　本研究中所用的細胞模型包括單核巨噬細胞(THP-1MΦ,RAW264.7,小鼠來源的原代腹腔巨噬細胞)和PBMC。結果顯示PBMC對SLY的敏感性明顯高于巨噬細胞。巨噬細胞主要位于不同組織中,屬于人體第一道防線的免疫細胞,此部位發(fā)生炎癥反應通過炎癥因子的釋放,可以幫助機體有效清除病原菌,將感染控制在局部。但是,細菌一旦進入血液中將

11、會是致命的,因為?mol/L的SLY蛋白短時間內即可誘導PBMC產(chǎn)生大量TNF-α,這種全身性釋放TNF-α可以引起休克。而在中國的豬鏈球菌病人血中可以輕易分離出該菌。所以SLY蛋白與PBMC的相互作用應當引起足夠的重視。
　　由于LPS可通過TLR4受體激活免疫細胞,釋放炎癥因子。因此本研究運用多種手段排除內毒素LPS的影響。
　　第一,基于LPS的熱穩(wěn)定性,作者對天然SLY蛋白進行加熱處理,再與細胞共孵育;
　　第

12、二,基于多粘菌素B可以使LPS失去誘導細胞產(chǎn)生炎癥因子的作用,作者將蛋白與多粘菌素B在4℃提前作用1小時,再與細胞共孵育;
　　第三,本研究運用Ttritoon X-114抽提去除重組蛋白中的LPS,使內毒素的含量符合國際標準(<5EU/mg);
　　最后,應用無關蛋白做對照,無關蛋白是豬鏈球菌的細胞壁蛋白,其誘導表達純化與去除LPS過程與rSLY和P353V均一致。
　　經(jīng)過以上處理后,實驗結果均證明,SLY可以誘導

13、細胞產(chǎn)生炎癥因子。
　　本研究首次揭示出SLY蛋白誘導細胞產(chǎn)生炎癥因子不依賴其溶血活性,并且此作用通過TLR4受體介導。S.suis與宿主相互作用具有雙刃劍的作用。S.suis分泌的毒力蛋白SLY具有溶血活性可以對真核細胞造成直接損傷,而SLY誘導細胞產(chǎn)生炎癥因子的作用又可以激活機體的免疫反應,從而幫助宿主清除病原菌。但是若S.suis分泌的SLY蛋白激活真核細胞過度釋放炎癥因子,則宿主容易發(fā)生TSLS。
　　SLY蛋白誘導