炎性因子OSM誘導乳腺癌惡性演進的分子機制研究.pdf

1、炎癥在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,被稱為“腫瘤的第七大特征”。炎性微環(huán)境中發(fā)生的一系列生物化學反應推動腫瘤的惡性轉化,上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤惡性轉化過程中的重要事件。在EMT轉化過程中,上皮細胞極性喪失,細胞-細胞及細胞-基質間的粘附減弱,上皮細胞的標志分子E-cadherin下調,間質細胞的標志分子Vimentin、Fibronectin及EMT的關鍵調

2、控分子ZEB1、Snail、Twist等表達上調。同時,一系列促轉移、促侵襲相關基因被誘導,使腫瘤細胞的遷移、侵襲能力增強。
　　炎性微環(huán)境中存在大量的炎性因子,已知炎性因子TNF-α、TGF-β、IL-6等參與了EMT過程。抑瘤素(OncostatinM,OSM)是IL-6家族的重要成員。前期研究提示,在腫瘤細胞培養(yǎng)上清中存在的OSM可能與EMT發(fā)生相關。在本研究中,我們通過對乳腺癌組織芯片(n=75)的免疫組化分析,觀察到約8

3、0％的乳腺癌組織高表達OSM,而乳腺良性疾病及正常乳腺組織中OSM的表達常呈陰性。OSM在乳腺癌組織中以自分泌和旁分泌的形式表達,特別在乳腺癌侵襲前緣,OSM表達呈強陽性,提示OSM可能參與乳腺癌的轉移調控。此外,對7種人乳腺癌細胞系的分析亦證實,具有高侵襲能力的MDA-231和MDA-435S細胞表達較高水平的OSM。體外實驗結果顯示,OSM刺激可誘導上皮型的MCF-7和T47D乳腺癌細胞向間質樣細胞轉化,E-cadherin下調,V

4、imentin、Fibronectin以及ZEB1、Snail表達上調,細胞的遷移、侵襲能力顯著增強,表明OSM是一個強有力的EMT誘導因子。
　　miRNA在EMT過程中執(zhí)行重要的功能,其中l(wèi)et-7及miR-200家族成員在EMT中的作用最受關注。在Src誘導的MCF-10A細胞轉化過程中,let-7參與NF-κB介導的表觀遺傳學調控,miR-200可直接抑制E-cadherin的轉錄抑制子(ZEB1和ZEB2)的表達,ZEB

5、1/miR-200正反饋調控環(huán)路在EMT中發(fā)揮重要的作用。我們的進一步研究發(fā)現(xiàn),OSM可誘導let-7及miR-200表達下調,但二者呈現(xiàn)獨特的變化特征,即let-7表現(xiàn)為瞬時下調,而miR-200的下調則較為滯后而持久。外源性過表達let-7或miR-200mimics,可逆轉OSM誘導的EMT發(fā)生,使E-cadherin表達得到恢復,并抑制Fibronectin和ZEB1表達,導致細胞的遷移、侵襲能力降低,提示let-7瞬時性下調及

6、miR-200持續(xù)性下調在OSM誘導的EMT過程中具有重要的意義。
　　OSM主要激活MEK、JAK/Stat、JNK等信號通路。我們利用MEK通路抑制劑PD98059、JNK通路抑制劑SP600125、JAK/Stat通路抑制劑WP1066預處理MCF-7細胞,發(fā)現(xiàn)這些抑制劑可不同程度地抑制OSM誘導的EMT。已知MEK、JNK、JAK2信號通路的激活均可導致Stat3活化。我們的研究證實,OSM刺激可誘導Stat3持續(xù)性活化,

7、而敲低Stat3可顯著抑制OSM誘導的EMT,并可逆轉OSM對let-7和miR-200的下調效應,而過表達組成型激活的Stat3C則可明顯下調let-7和miR-200的表達。miRNA主要通過與其靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結合而調控靶基因的表達。為了進一步證實Stat3對let-7及miR-200的調控作用,我們分別構建了含let-7和miR-200靶基因HMGA23’UTR及ZEB13’UTR的熒光素酶報告載體,分別用這些

8、載體與Stat3C表達質粒共轉染MCF-7細胞。結果顯示,過表達Stat3C可明顯增強HMGA23’UTR及ZEB13’UTR的活性,而對HMGA25’UTR無影響。敲低Stat3或抑制Stat3信號通路活化均可抑制let-7靶基因HMGA2的表達,進一步表明Stat3對let-7和miR-200的表達具有特異性的調控作用,提示Stat3可能是OSM誘導EMT的關鍵調控分子,通過調控miRNA表達而影響EMT程序。
　　我們發(fā)現(xiàn),

9、與OSM誘導的let-7瞬時性下調相呼應的是,let-7靶基因HMGA2、c-Myc、Ras均出現(xiàn)瞬時性表達增強,過表達let-7mimics能抑制OSM對HMGA2、c-Myc、Ras的誘導作用。值得注意的是,HMGA2是一個胚胎早期基因,在胚胎發(fā)育期高表達于未分化的增殖性細胞,而在成體組織中不表達;let-7的表達恰與之相反,在胚胎階段難以檢測到,而在胚胎發(fā)育末期開始上調,提示let-7-HMGA2軸的瞬時變化在OSM誘導的EMT中

10、可能是一個始動效應。我們發(fā)現(xiàn),敲低HMGA2可顯著逆轉EMT表型,抑制乳腺癌細胞的侵襲能力,并可使OSM誘導的miR-200下調得到恢復,表明let-7和HMGA2的表達動力學變化不僅對于OSM誘導的表觀調控具有啟動作用,而且對于miR-200的下調亦產(chǎn)生重要的影響。
　　通過對let-7轉錄本(pri-let-7)及成熟體(mat-let-7)表達的分析,我們發(fā)現(xiàn)OSM影響了let-7成熟體的表達,提示Stat3激活可能影響le

11、t-7加工成熟。已知RNA結合蛋白Lin-28A和Lin-28B是let-7家族成員加工成熟的關鍵負調控分子。我們觀察到,OSM可誘導Lin-28B的瞬時性表達增強,此表達變化特征與let-7下調的動力學變化一致。敲低Lin-28B表達可顯著削弱OSM誘導的EMT效應,揭示了Lin-28B-let-7-HMGA2軸的瞬時激活在OSM誘導的EMT過程中的關鍵作用。對Lin-28B啟動子序列分析顯示,Lin-28B啟動子序列中含有6個Sta

12、t3的潛在結合位點。我們通過ChIP實驗證實,外源性及內源性Stat3均能與Lin-28B啟動子-2405和-369bp區(qū)的Stat3反應元件結合。更為重要的是,在OSM誘導下,內源性Stat3與Lin-28B啟動子的結合具有與Lin-28B表達、let-7下調及HMGA2上調相似的時空特征。以上證據(jù)證明,OSM誘導的Lin-28B一過性表達增強決定了let-7-HMGA2軸的瞬時開啟。
　　為了驗證OSM是否可在體內誘導EMT,

13、我們建立了穩(wěn)定表達GFP的MCF-7/GFP乳腺癌細胞移植瘤模型。當瘤體可觸及時,進行瘤體內注射OSM,每周一次,連續(xù)6周。60天后處死動物,分離瘤體、肺、肝組織,對瘤組織稱重,并作H&E染色和抗GFP抗體免疫組化染色。結果發(fā)現(xiàn),OSM處理明顯誘導了乳腺癌自發(fā)性肺轉移。對瘤組織分析結果顯示,OSM處理組的腫瘤組織中E-cadherin表達下調,Vimentin和ZEB1表達上調,Stat3磷酸化水平升高。同時,一系列與轉移侵襲相關的基因

14、(MMP-2、MMP-7、MMP-9、COX-2、CXCR-4)均被誘導表達。對瘤組織miRNA分析的結果顯示,OSM處理組let-7表達與對照組似無明顯差別。但是,OSM注射組的瘤組織中miR-200顯著下調。這些結果充分表明,OSM在體內亦具有促EMT效應,并提示OSM誘導的miR-200-ZEB1軸在腫瘤惡性表型的維持過程中發(fā)揮重要作用。
　　上述研究結果證實,OSM誘導的EMT受轉錄因子及miRNA共同構成的復雜網(wǎng)絡調控,

15、而Stat3協(xié)調、控制并決定了Lin-28B-let-7-HMGA2及miR-200-ZEB1軸的動力學變化,開啟并維持乳腺癌EMT過程,賦予乳腺癌細胞明顯的間質樣表型,促進乳腺癌的惡性進展。我們的研究首次報道了OSM的體內促EMT效應及OSM在乳腺癌惡性演進中的作用;首次揭示了OSM誘導乳腺癌細胞發(fā)生EMT的“開關維持”機制;首次報道了Stat3對Lin-28B的轉錄調控作用。我們的研究成果為炎性微環(huán)境誘導腫瘤惡性轉化的分子調控網(wǎng)絡提