JEV PrM-M蛋白單克隆抗體的制備及JEV P3感染U251細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、日本乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）是由日本乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)引起的一種嚴重影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的蟲媒性人獸共患傳染病。PrM蛋白是JEV的結(jié)構(gòu)蛋白之一，主要存在于感染細胞內(nèi)未成熟的病毒顆粒中。M蛋白由PrM蛋白切割而來，參與病毒囊膜的構(gòu)成，與E蛋白的C端相互作用，在細胞內(nèi)對E蛋白進行折疊、修飾和裝配，可誘生輕度中和抗體，與病毒核心組成具有感染性的病毒

2、。同時JEV靶向神經(jīng)元，可激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞信號，誘發(fā)大量細胞因子和促炎癥因子的分泌，引起大腦炎癥風(fēng)暴。但是，PrM在病毒復(fù)制、感染以及誘導(dǎo)中和抗體活性中的功能還不清楚，同時在細胞內(nèi)如何對E蛋白進行折疊、修飾和裝配也不清楚。另外JEV在引起大腦炎癥風(fēng)暴的過程中，還有哪些潛在的蛋白會產(chǎn)生作用，也沒有得到完整的解答。
　　本研究制備了PrM/M的單克隆抗體，并通過間接ELISA、IFA、Western Blo

3、t等方法驗證單抗的生物學(xué)特性。同時，利用iTRAQ技術(shù)對JEV P3感染U251細胞的蛋白質(zhì)組進行了分析。
　　具體研究內(nèi)容如下:
　　1、JEV PrM/M單克隆抗體的制備
　　構(gòu)建JEV M蛋白的原核表達質(zhì)粒p28a-sumo-M，并純化蛋白免疫小鼠，通過細胞融合，結(jié)合間接ELISA和亞克隆技術(shù)篩選到1株特異性的單克隆抗體:6C11，同時獲得4株能穩(wěn)定分泌單抗的亞克隆株:E2、G3、D4、E4。經(jīng)檢測，四株亞克隆株

4、的亞型均為IgG2b，輕鏈均為Kappa鏈。經(jīng)間接ELISA、IFA、Western Blot技術(shù)檢測，這4株單抗均有較好的特異性，能識別天然的PrM/M蛋白，同時收取的腹水效價能達到105。根據(jù)DNA Star軟件預(yù)測M蛋白抗原位點可能存在的區(qū)域，將M蛋白分段表達，構(gòu)建了pKG-M1和pKG-M2兩段原核表達質(zhì)粒，經(jīng)Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)M蛋白的抗原位點可能存在前半段，即第1-126個堿基區(qū)。
　　2、JEV P3感染

5、U251細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　將JEV P3株感染U251細胞后，收集細胞樣品，利用iTRAQ技術(shù)對樣品進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。鑒定出有意義蛋白共1780種，其中大部分蛋白參與細胞和細胞器的組成，部分蛋白參與新陳代謝、生物調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答和刺激，還有少數(shù)蛋白參與酶活性的調(diào)節(jié)、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運輸。對蛋白進行定量分析，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，在感染病毒的U251細胞中共鑒定到54種上調(diào)表達蛋白和35種下調(diào)表達蛋白，利用相對熒光定量技術(shù)檢測了8