α1-抗胰蛋白酶對白蛋白-胰島素結(jié)合抑制作用及其機(jī)制.pdf

1、第一部分α1抗胰蛋白酶對白蛋白-胰島素結(jié)合力及其對血糖的條件作用
　　糖尿病是一種以血糖代謝紊亂為特點的常見慢性疾病，其中90％以上為2型糖尿病(type2 diabetes，T2DM)。近年來研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗在2型糖尿病發(fā)病中起重要作用，并貫穿于2型糖尿病全過程。關(guān)于胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，各種實驗研究結(jié)果顯示，胰島素抵抗的發(fā)生多是與炎癥反應(yīng)、激素因子作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及過量的營養(yǎng)產(chǎn)物在胰島素敏感組織堆積等共同作用有

2、關(guān)。妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指在妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖代謝異常。GDM發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，它由多種因素作用所致，胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞分泌降低是GDM發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。
　　白蛋白是最主要的血漿蛋白之一，在大量內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的結(jié)合和轉(zhuǎn)運方面發(fā)揮重要的作用。白蛋白具有胰島素樣或是抑制胰島素樣活性，而且血清中的胰島素大多與血清蛋白相結(jié)合。我們之前的研究結(jié)果

3、表明:首先，在血清中存在兩種不同形式的胰島素即游離胰島素和結(jié)合胰島素。游離胰島素作為活性形式而結(jié)合胰島素作為非活性形式存在;其次，血清白蛋白作為胰島素的轉(zhuǎn)運體和存儲體;最后，白蛋白和胰島素的結(jié)合與解離可以調(diào)節(jié)血糖水平和細(xì)胞功能。根據(jù)以上三點，我們提出胰島素抵抗發(fā)生機(jī)制的新設(shè)想:我們假設(shè)游離胰島素是作為可供機(jī)體立即利用的活性形式，結(jié)合胰島素則處于非活性狀態(tài)，但可從結(jié)合蛋白質(zhì)中分離從而保持游離胰島素水平的穩(wěn)定。在某些病理狀態(tài)下，例如高脂血癥

4、和肥胖時，這種平衡可以發(fā)生改變。如果血清白蛋白-胰島素結(jié)合力增加，則可供利用的游離胰島素水平降低;相反，如果血清白蛋白-胰島素結(jié)合力降低，由于游離胰島素半衰期很短，則可供利用的游離胰島素水平在餐后上升而在空腹水平時下降。不論是在哪種條件下，胰腺都要分泌更多的胰島素以維持血糖在空腹和餐后狀態(tài)下的正常水平。如果這種補(bǔ)償機(jī)制失衡，則正常的空腹血糖水平無法維持。因此，在我們接下來的研究中，將會著重探索影響白蛋白-胰島素結(jié)合力的未知的病理因素及其

5、是如何發(fā)揮作用的，從而為我們所提出的胰島素抵抗的新設(shè)想以至糖尿病的發(fā)生機(jī)制提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。我們的實驗主要分為兩部分:
　　第Ⅰ部分:2型糖尿病與妊娠期糖尿病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。我們采用2型糖尿病病人和妊娠期糖尿病病人分別與其對照者的血清進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選出這兩組病人與其對照在血清蛋白表達(dá)上的共同點，發(fā)現(xiàn)可能影響白蛋白-胰島素結(jié)合力的重要因子。12例2型糖尿病病人和10例匹配對照者的血清以及9例妊娠期糖尿病病人和8例匹配對

6、照者的血清用來進(jìn)行雙向電泳，隨后用軟件對圖譜進(jìn)行分析和匹配，并對在兩組中發(fā)生相同顯著差異變化的4種蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果顯示:2型糖尿病病人和對照者血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜進(jìn)行圖像分析和匹配后發(fā)現(xiàn)，兩種圖譜的蛋白點數(shù)分別為465±11和423±15，其中共有269個蛋白點相互匹配，匹配率平均為61％。在這些匹配的蛋白點中，共有19個蛋白點發(fā)生顯著性差異變化（以3倍變化幅度為基準(zhǔn)），其中在2型糖尿病中表達(dá)上調(diào)的蛋白點有8個，表達(dá)下調(diào)的蛋白

7、點有11個。對妊娠期糖尿病病人和其對照者血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜進(jìn)行分析和匹配后發(fā)現(xiàn)，兩種圖譜的蛋白點數(shù)分別為325±18和342±10，其中共有197個蛋白點相互匹配，匹配率平均為59％。在這些匹配的蛋白點中，共有30個蛋白點發(fā)生顯著性差異變化（以3倍變化幅度為基準(zhǔn)），其中在妊娠期糖尿病中表達(dá)上調(diào)的蛋白點有19個，表達(dá)下調(diào)的蛋白點有11個。綜合分析上述發(fā)生變化的蛋白點，我們發(fā)現(xiàn)有2個蛋白點在2型糖尿病和妊娠期糖尿病病人血清中均表達(dá)上調(diào)，

8、同時也有2個蛋白點在這兩組病人血清中均表達(dá)下調(diào)。對這4種蛋白點的質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示它們分別為α1抗胰蛋白酶、血管緊張素原、凝集素和人血白蛋白與十四酸和三碘苯甲酸的復(fù)合物。其中α1抗胰蛋白酶和血管緊張素原在兩組糖尿病中表達(dá)下降，與對照組的相對表達(dá)量分別是-3.82±0.73和-4.76±0.33;而凝集素和人血白蛋白與十四酸和三碘苯甲酸的復(fù)合物在兩組糖尿病中表達(dá)上升，與對照組的相對表達(dá)量分別是15.6±2.49和3.13±0.23。

9、　　第Ⅱ部分:α1抗胰蛋白酶對白蛋白-胰島素結(jié)合力的影響。在第Ⅰ部分的實驗中，我們研究發(fā)現(xiàn)了在兩組糖尿病病人中發(fā)生改變的4種蛋白質(zhì)，其中α1抗胰蛋白酶在血清中的數(shù)量級最高，與白蛋白的分子數(shù)最為匹配，預(yù)計對白蛋白的結(jié)合或解離狀態(tài)影響最大，因此，我們選擇α1抗胰蛋白酶作為研究對象，觀察其在影響白蛋白-胰島素結(jié)合力方面所發(fā)揮的作用。首先，我們用免疫共沉淀的方法去證明血清中白蛋白和α1抗胰蛋白酶的結(jié)合。用α1抗胰蛋白酶的抗體去沉淀與之結(jié)合的蛋白

10、，非特異IgG作為對照。結(jié)果顯示在α1抗胰蛋白酶抗體組可明顯檢測到α1抗胰蛋白酶，同時也可以檢測到大量白蛋白;在非特異IgG組則未發(fā)現(xiàn)有α1抗胰蛋白酶。然后，我們用體外實驗證明不同濃度α1抗胰蛋白酶對白蛋白-胰島素結(jié)合力的影響。結(jié)果顯示:與正常濃度α1抗胰蛋白酶/白蛋白組相比，低濃度α1抗胰蛋白酶明顯增加了結(jié)合胰島素/游離胰島素的比值(2.41±0.17 vs1.76±0.20，P=0.0024);低濃度α1抗胰蛋白酶/白蛋白組和高濃度

11、α1抗胰蛋白酶/白蛋白組之間該比值更加明顯(2.41±0.17 vs1.53±0.18，P=0.0004);而正常濃度α1抗胰蛋白酶/白蛋白組和高濃度α1抗胰蛋白酶/白蛋白組之間該比值沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.1406)。
　　接下來，我們觀察了白蛋白和胰島素對小鼠血清α1抗胰蛋白酶濃度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在α1抗胰蛋白酶/白蛋白低于正常時，注射白蛋白可提高血清α1抗胰蛋白酶濃度，而α1抗胰蛋白酶/白蛋白正?；蛘吒哂谡r，白蛋白對α1

12、抗胰蛋白酶濃度無影響。相反，注射胰島素可顯著降低注射PBS或者少量（0.64mg/ml）α1抗胰蛋白酶小鼠的血清α1抗胰蛋白酶濃度。由于免疫共沉淀結(jié)果顯示血清中胰島素與α1抗胰蛋白酶不結(jié)合，這就提示胰島素與α1抗胰蛋白酶競爭結(jié)合白蛋白。
　　我們進(jìn)一步觀察白蛋白/α1抗胰蛋白酶比值對血糖濃度的影響，結(jié)果顯示:低α1抗胰蛋白酶(0.64mg/ml)/白蛋白比值組中小鼠的血糖水平明顯升高，阻止了胰島素誘導(dǎo)的低血糖反應(yīng)。將注射液的α1抗

13、胰蛋白酶的濃度增加到2.58mg/ml和10.30mg/ml后，胰島素誘導(dǎo)的低血糖反應(yīng)則出現(xiàn)加大且延長。α1抗胰蛋白酶的濃度與血糖水平的變化呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系。注射不含白蛋白的α1抗胰蛋白酶溶液則與注射正常和高α1抗胰蛋白酶/白蛋白比值組類似。因此，我們認(rèn)為α1抗胰蛋白酶通過抑制白蛋白和胰島素的結(jié)合來發(fā)揮降血糖的作用。
　　我們首次發(fā)現(xiàn)α1抗胰蛋白酶可通過與胰島素競爭結(jié)合白蛋白，促使胰島素從胰島素-白蛋白復(fù)合物中解離和利用，從而調(diào)節(jié)

14、血糖水平。低α1抗胰蛋白酶血癥可能是2型糖尿病和妊娠期糖尿病胰島素抵抗的重要機(jī)制，為糖尿病的發(fā)生和發(fā)展提供了新的機(jī)制，具有臨床潛在應(yīng)用價值。
　　第二部分 apoE基因敲除小鼠心臟中動脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)節(jié)律改變的研究
　　晝夜節(jié)律生物鐘(circadian clock)參與調(diào)控機(jī)體行為與各項生理功能。晝夜節(jié)律的產(chǎn)生依賴于各種生物鐘基因(clock gene)的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路。鐘基因可以通過調(diào)節(jié)下游的鐘控基因(CCGs

15、)調(diào)節(jié)多項生理功能。研究表明，晝夜節(jié)律生物鐘不僅參與生理功能的調(diào)節(jié)，在多種病理過程中如心血管系統(tǒng)疾病、腫瘤中也發(fā)揮了重要的作用。
　　急性心肌梗塞(Acute Myocardial Infarction，AMI)是動脈粥樣硬化的終末病變，其發(fā)病具有明確的晝夜節(jié)律，在早晨高發(fā)。目前對這種現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制還未研究清楚，但可能與晝夜節(jié)律生物鐘有關(guān)。本研究將利用apoE基因敲除（apoE-/-）小鼠建立動脈粥樣硬化模型，以研究動脈粥樣硬化發(fā)

16、病過程中動脈粥樣硬化相關(guān)基因:纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(Pai-1)、組織因子(TF)、內(nèi)皮素-1(ET-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1、MMP-2及MMP-9）的晝夜節(jié)律表達(dá)變化，為研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　apoE-/-小鼠心臟動脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)節(jié)律的改變。利用apoE-/-小鼠建立動脈粥樣硬化早期及進(jìn)展期動物模型。使用3月齡apoE-/-小鼠48只，分為兩組，每組2

17、4只，一組給予普通膳食，一組西方類型膳，以24只同齡雄性C57BL/6J作為對照，在12光照/12黑暗(12L/12D)環(huán)境中飼養(yǎng)4周。根據(jù)Zeitgaber Time，分別在ZT0、ZT4、ZT8、ZT10、ZT12、ZT14、ZT16、ZT20八個時間點處死小鼠;取小鼠主動脈起始段做冰凍切片，油紅O染色檢測動脈粥樣斑塊;取小鼠心臟液氮速凍，-70℃冰箱保存。利用Real-time RCR檢測apoE-/-與C57BL/6J小鼠心臟動

18、脈粥樣硬化相關(guān)基因t-PA、Pai-1、TF、ET-1和MMP-1、MMP-2及MMP-9在不同時間點的表達(dá)變化。結(jié)果顯示給予了普通膳食的apoE-/-小鼠尚未形成明顯的粥樣斑塊，但其主動脈內(nèi)皮下已經(jīng)形成泡沫細(xì)胞;給予西方類型膳的apoE-/-小鼠主動脈有明顯的動脈粥樣硬化斑塊出現(xiàn)，油紅O染色顯示粥樣斑塊內(nèi)存在明顯的脂質(zhì)沉積。因此，給予普通膳食與西方類型膳的apoE-/-小鼠分別處于動脈粥樣硬化的早期與進(jìn)展期。Real-time PCR

19、結(jié)果顯示C57BL/6J小鼠心臟中Pai-1，t-PA，TF和ET-1的表達(dá)高峰出現(xiàn)在ZT14和ZT16之間，表達(dá)低谷出現(xiàn)在ZT10;在給予普通膳食的apoE-/-小鼠中三者表達(dá)失去了節(jié)律;而在給予西方類型膳的apoE-/-小鼠中表達(dá)高峰在ZT4，表明三者表達(dá)節(jié)律出現(xiàn)完全相反的變化。在C57BL/6J小鼠和apoE-/-小鼠心臟中MMP-1、MMP-2及MMP-9三種基因的表達(dá)均未出現(xiàn)明顯的節(jié)律變化。
　　綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)a