基于蛋白質(zhì)組學(xué)的血管細胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò).pdf

1、血管重建(remodeling)是很多心腦血管疾病，如高血壓、動脈粥樣硬化、腦卒中等的共同發(fā)病基礎(chǔ)以及其病理的基本過程。研究表明，機械應(yīng)力誘導(dǎo)的血管重建在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。探索機械應(yīng)力誘導(dǎo)動脈血管重建的分子機制，尋找生理和病理過程中關(guān)鍵的標記分子和潛在的藥物靶標，對于動脈粥樣硬化及其相關(guān)疾病的病理研究及臨床治療具有非常重要的意義。
　　本研究首先在低切應(yīng)力(5 dyn/cm2)與正常切應(yīng)力(15 d

2、yn/cm2)條件下分別體外培養(yǎng)大鼠血管，應(yīng)用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜分析的方法，鑒定出血管組織具有顯著性表達差異的43個蛋白質(zhì)。對這些蛋白采用基于Gene Ontology和IPA的功能與信號通路分析，預(yù)測了4個切應(yīng)力相關(guān)的信號網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了Lamin A，LOX，RACK1，Rab28等新的力學(xué)敏感分子。這些分子在應(yīng)力誘導(dǎo)血管重建中的作用及其分子機制尚未見到研究報道。然后，我們采用平行平板流動腔系統(tǒng)對聯(lián)合培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞(endothelial

3、 cells，ECs)與平滑肌細胞(vascular smoothmuscle cells，VSMCs)加載切應(yīng)力，應(yīng)用western blotting方法檢測不同水平切應(yīng)力條件下細胞內(nèi)Lamin A和LOX表達。結(jié)果證實，LaminA和LOX為力學(xué)刺激敏感分子，低切應(yīng)力抑制ECs和VSMCs的Lamin A表達，而促進LOX表達。應(yīng)用RNA干擾和重組蛋白刺激等分子生物學(xué)方法，驗證了IPA預(yù)測的切應(yīng)力信號通路網(wǎng)絡(luò)中與LaminA和LOX

4、相關(guān)的部分關(guān)鍵節(jié)點表達及其調(diào)控關(guān)系。
　　由于絕大多數(shù)信號分子是通過磷酸化/去磷酸化修飾而改變其活性來發(fā)揮作用，我們又應(yīng)用穩(wěn)定同位素標記氨基酸活細胞培養(yǎng)(SILAC)、色譜分離磷酸化蛋白和質(zhì)譜技術(shù)，得到了周期性張應(yīng)變加載條件下，VSMCs的磷酸化蛋白質(zhì)隨時間的表達變化及相應(yīng)的磷酸化位點?；谏鲜鰯?shù)據(jù)，應(yīng)用聚類分析和功能分析等生物信息學(xué)與計算生物學(xué)方法，分析了張應(yīng)變條件下VSMCs蛋白質(zhì)磷酸化的表達模式，以及在不同時間點差異表達的磷

5、酸化蛋白質(zhì)所參與的細胞功能和信號通路，并構(gòu)建了VSMCs在張應(yīng)變刺激下的動態(tài)磷酸化信號網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果除揭示了新的、可能參與應(yīng)力細胞內(nèi)傳導(dǎo)的信號途徑外，還提示，細胞骨架結(jié)構(gòu)可能直接感受應(yīng)力刺激并調(diào)控多種結(jié)合(binding)蛋白活性，進而調(diào)控細胞功能，為血管細胞將細胞外機械應(yīng)力信號轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)生物化學(xué)信號的“應(yīng)力感受器”研究提供了新的依據(jù)。
　　為進一步深入分析上述蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，揭示更多的、有價值的機械應(yīng)力作用下血管細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)

6、信息，尤其是直接調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子信息，我們探索了應(yīng)用大規(guī)模基因微陣列數(shù)據(jù)推斷轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的新方法，并應(yīng)用于我們的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析及力學(xué)信號網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。首先提出了平均三元互信息(AMI3)與網(wǎng)絡(luò)輔助回歸分析算法，這一從大規(guī)?；蛭㈥嚵行酒瑪?shù)據(jù)重建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的新方法，并應(yīng)用大腸桿菌、酵母菌和人的B細胞微陣列數(shù)據(jù)，對該方法的準確性和可靠性進行驗證。然后，我們構(gòu)建了人臍靜脈ECs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合低切應(yīng)力條件下ECs的基因微陣列數(shù)據(jù)

7、與血管細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，應(yīng)用AMI3結(jié)合網(wǎng)絡(luò)輔助回歸分析，構(gòu)建了ECs響應(yīng)切應(yīng)力的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控耦合網(wǎng)絡(luò)，更全面地描述了機械應(yīng)力在血管細胞內(nèi)從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到基因表達的調(diào)控過程。
　　然后，我們提出網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點之間的圖元相互作用的概念，并預(yù)測了心血管疾病相關(guān)基因。研究發(fā)現(xiàn)，疾病基因之間的圖元相互作用與普通基因之間具有明顯差異。根據(jù)這種差異用圖元相互作用構(gòu)造新的得分指數(shù)，可用來鑒定疾病基因。我們基于OMIM數(shù)據(jù)庫中已知疾病基因信息，

8、采用棄一法交叉檢驗，發(fā)現(xiàn)基于圖元相互作用的疾病基因鑒定方法與之前的隨機游走和Endeavour等方法相比，具有更高的準確度和穩(wěn)定性。最后，我們將經(jīng)過驗證的上述方法用于預(yù)測高血壓和冠狀動脈粥樣硬化相關(guān)的基因，得到了NOS2與VEGFR1等12個新基因。
　　上述研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)與計算生物學(xué)方法，構(gòu)建機械應(yīng)力作用下血管細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了新的可能參與機械應(yīng)力感受、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子，并應(yīng)用分子生物學(xué)方法對