胰酶化和鈣化對(duì)異體滑膜內(nèi)肌腱與骨隧道愈合作用研究.pdf

1、第一章:對(duì)比研究狗趾深屈肌腱、前交叉韌帶、跟腱和髕腱之間的差異
　　目的:本實(shí)驗(yàn)的主要目的為對(duì)比研究狗趾深屈肌腱、前交叉韌帶、跟腱和髕腱之間在生物力學(xué)和組織學(xué)上的差異。
　　方法:20只狗后腿用于獲取趾深屈肌腱(N=20)、前交叉韌帶(N=20)、跟腱中間束(N=20)和帶1/3髕腱的骨-髕腱-骨(N=20)。利用摩擦力測(cè)試、壓痕實(shí)驗(yàn)、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)等方法以評(píng)估之間的差異。
　　結(jié)果:摩擦力測(cè)試發(fā)現(xiàn)，第1個(gè)循環(huán)時(shí)

2、，與髕腱組（336.62±110.87 mN）和跟腱組（147.89±54.73 mN）相比，趾深屈肌腱組(47.24±14.40 mN)和前交叉韌帶組（51.98±12.10 mN）摩擦力顯著較小(P＜0.05)。第5個(gè)循環(huán)時(shí)，與髕腱組（414.29±104.49 mN）和跟腱組（260.11±99.11 mN）相比，趾深屈肌腱組(88.73±18.33 mN)和前交叉韌帶組(126.88±50.83mN)摩擦力亦顯著較小(P＜0.0

3、5)。第10個(gè)循環(huán)時(shí)，與髕腱組(442.12±106.69mN)相比，趾深屈肌腱組（132.53±26.08 mN）、前交叉韌帶組（196.69±84.80mN）和跟腱組(311.89±124.78 mN)摩擦力顯著較小(P＜0.05)。第100個(gè)循環(huán)時(shí)，與髕腱組（571.06±132.50 mN）相比，趾深屈肌腱組（397.26±39.98mN）和前交叉韌帶組（396.53±90.59mN）摩擦力顯著較小(P＜0.05)。壓痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

4、，與髕腱組抗壓模量(2.85±0.43 MPa)相比，趾深屈肌腱組(4.11±0.34 MPa)、前交叉韌帶組(3.54±0.32 MPa)和跟腱組(4.71±0.38MPa)的抗壓模量均顯著較高(P＜0.05)。組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)趾深屈肌腱和前交叉韌帶的腱外膜光滑，由單一肌腱外膜細(xì)胞覆蓋;而髕腱和跟腱表面相對(duì)粗糙，腱旁組織清晰可見。Lubricin在趾深屈肌腱和前交叉韌帶的表面有大量的表達(dá)，在細(xì)胞外基質(zhì)和膠原纖維間也有少量表達(dá)。在跟腱的腱

5、旁組織可見Lubricin表達(dá)，但肌腱表面Lubricin表達(dá)較少，腱旁組織和肌腱組織之間可見Lubricin表達(dá)，在肌腱的細(xì)胞外基質(zhì)和膠原纖維間也有少量表達(dá)。在髕腱的腱旁組織、肌腱的細(xì)胞外基質(zhì)和膠原纖維間可見少量Lubricin表達(dá)。
　　結(jié)論:趾深屈肌腱和前交叉韌帶具有類似的表面摩擦力，且顯著低于跟腱和髕腱，這些特點(diǎn)與肌腱Lubricin表達(dá)特點(diǎn)相吻合。
　　第二章:滑膜內(nèi)肌腱體外鈣化過程優(yōu)化
　　目的:骨腱界面愈

6、合是臨床上最富有挑戰(zhàn)性的問題。本研究的主要目的就是優(yōu)化肌腱鈣化的條件，為下一步的鈣化肌腱體內(nèi)研究做準(zhǔn)備，并為促進(jìn)骨腱界面愈合提供新的思路。
　　方法:60根趾深屈肌腱隨機(jī)分成5組:1）正常肌腱組(Normal);2)不提取和無胎球蛋白鈣化組（CaP）;3）提取和無胎球蛋白鈣化組(CaPEXT);4)不提取和有胎球蛋白鈣化組(CaPFetuin)和5）提取和有胎球蛋白鈣化組(CaPEXTFetuin)。提取組為在3％磷酸氫二鈉溶液中

7、緩慢攪拌并連續(xù)提取3天。胎球蛋白組除了使用普通中性鈣鹽和磷酸鹽溶液外，鈣化溶液還含有胎球蛋白。這些樣本使用組織學(xué)、掃描電鏡、壓痕實(shí)驗(yàn)和縫線拔出測(cè)試等方法進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:CaP組肌腱表面可見到少量鈣磷結(jié)晶附著。CaPEXT組肌腱可以見到少量磷酸鈣滲透到肌腱內(nèi)部，但深度很小。與CaP組和CaPEXT組肌腱鈣化相比，CaPFetuin組肌腱有更深的磷酸鈣進(jìn)入肌腱內(nèi)部，但是鈣化在肌腱組織內(nèi)深度仍然有限。然而磷酸鈣在CaPEXTFet

8、uin組肌腱內(nèi)部滲透的更深，可達(dá)200μm。鈣鹽和磷酸鹽含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，與CaPEXTFetuin組中的鈣離子和磷酸根含量(4.82±0.59μmol和2.83±0.37μmol)相比，正常肌腱組（0.18±0.1μmol和0.02±0.01μmol）、CaP組（1.08±0.3μmol和0.65±0.21μmol）、CaPEXT組（1.6±0.45μmol和0.96±0.27μmol）和CaPFetuin組（3.27±0.35μmol和

9、1.9±0.2μmol）中的鈣離子和磷酸根含量顯著較低(P＜0.05)。在CaP和CaPEXT組，可以見到有大量的鈣磷結(jié)晶沉淀在肌腱表面上。然而，在CaPFetuin和CaPEXTFetuin組，并沒有見到明顯鈣磷結(jié)晶沉淀在肌腱表面上，膠原纖維大小與正常肌腱的膠原纖維大小沒有看到明顯差異，鈣化主要存在于肌腱的膠原纖維內(nèi)。壓痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組肌腱的抗壓模量(4.34±0.59 MPa)相比，CaP組（3.43±0.2 MPa）、Ca

10、PEXT組（3.12±0.2 MPa）、 CaPFetuin組（3.56±0.31 MPa）和CaPEXTFetuin組（3.33±0.18 MPa）肌腱的抗壓模量均顯著降低(P＜0.05)?？p線拉出測(cè)試的最大拉斷負(fù)荷在五組之間均無顯著差異，其中正常組(14.11±4.07 N)、CaP組(13.98±4.27 N)、CaPEXT(14.3±4.32 N)、CaPFetuin組(15.7±4.05 N)和CaPEXTFetuin組(16

11、.57±4.56 N)(P＞0.05)。
　　結(jié)論:磷酸氫二鈉提取與胎球蛋白增強(qiáng)作用聯(lián)合能夠顯著提高肌腱的鈣化程度并在肌腱內(nèi)形成了梯度的鈣化區(qū)。這些發(fā)現(xiàn)可能對(duì)改善腱-骨愈合和促進(jìn)骨腱鏈接點(diǎn)損傷后梯度界面再生有重要意義。但是還需要進(jìn)一步的動(dòng)物體內(nèi)研究來證明這種新穎的鈣化肌腱對(duì)骨腱愈合的作用。
　　第三章:胰酶化和鈣化對(duì)同種異體滑膜內(nèi)肌腱與骨愈合的作用
　　目的:本研究意在制備一種經(jīng)過胰蛋白酶消化和鈣化的同種異體滑膜內(nèi)肌腱

12、，并將其植入兔脛骨近端骨隧道模型，研究其對(duì)腱-骨界面愈合作用。
　　方法:8根趾深屈肌腱(FDP)用于優(yōu)化胰蛋白酶消化時(shí)間。24根趾深屈肌腱隨機(jī)分為對(duì)照組(N=12)和胰蛋白酶化鈣化組（N=12）。其中每組4根肌腱用于體外評(píng)估胰蛋白酶化鈣化效果。每組其余8根肌腱移植到兔脛骨近端骨隧道模型。通過組織學(xué)和生物力學(xué)等方法來檢測(cè)胰蛋白酶化鈣化技術(shù)對(duì)腱-骨界面愈合的作用。
　　結(jié)果:經(jīng)過胰蛋白酶消化10分鐘的肌腱，肌腱表面沒有Lubr

13、icin的表達(dá)，只在肌腱細(xì)胞外基質(zhì)有少量的Lubricin表達(dá)。因此本研究采用10分鐘胰蛋白酶消化時(shí)間作為最佳消化時(shí)間。組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶化鈣化組肌腱在鈣化和未鈣化之間有明顯的界限。遠(yuǎn)端1cm部分肌腱表面的鈣化表現(xiàn)為梯度鈣化，而其他部分并沒有見到肌腱鈣化的現(xiàn)象。Lubricin免疫組化染色發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端1cm部分肌腱表面沒有Lubricin的表達(dá)，只在肌腱細(xì)胞外基質(zhì)有少量的Lubricin表達(dá)，而肌腱的其他部分可以在其表面和細(xì)胞外基質(zhì)上見

14、到Lubricin表達(dá)。組織學(xué)檢測(cè)骨隧道內(nèi)肌腱部分，在正常對(duì)照組中可見到有一層薄的纖維瘢痕組織在肌腱與骨隧道界面形成。然而在胰蛋白酶化鈣化組中，可以見到明顯厚的纖維瘢痕組織在肌腱與骨隧道界面形成。更重要的是，胰蛋白酶化鈣化組可以見到有明顯的新骨在肌腱移植物內(nèi)形成。與胰蛋白酶化鈣化組相比，正常對(duì)照組的腱骨界面可以見到更多的空隙區(qū)域。此外，正常對(duì)照組和胰蛋白酶化鈣化組均可見到大量單核細(xì)胞在肌腱內(nèi)部浸潤。正常對(duì)照組（5.76±3.21N）和胰