日本囊對(duì)蝦中抗菌肽分子基因克隆及功能分析.pdf

1、在無(wú)脊椎動(dòng)物中，由于其缺少傳統(tǒng)意義上的適應(yīng)性免疫，先天免疫系統(tǒng)在宿主對(duì)抗病原體的反應(yīng)中發(fā)揮著非常重要的作用。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)在先天免疫防御中發(fā)揮著效應(yīng)分子的作用，可以直接殺死或清除病原微生物。在本論文中，以日本囊對(duì)蝦為材料，對(duì)抗菌肽家族（含WAP結(jié)構(gòu)域蛋白和抗脂多糖因子）中的成員進(jìn)行了研究，得到以下結(jié)果:
　　1.日本囊對(duì)蝦含單一單一乳清酸性蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域的抗菌肽的功能研究

2、r>　　甲殼動(dòng)物中含單一乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域(a single whey acidic protein domain，SWD)的抗菌肽屬于Ⅲ型甲殼肽，具有蛋白酶抑制活性或抑菌活性。然而它在甲殼動(dòng)物體內(nèi)的功能尚未被闡述。在本論文中，在日本囊對(duì)蝦中擴(kuò)增得到一種SWD抗菌肽，稱為MjSWD。MjSWD的全長(zhǎng)為522bp，開(kāi)放閱讀框編碼一條含24個(gè)氨基酸信號(hào)肽的蛋白。組織分布結(jié)果顯示，MjSWD在血細(xì)胞、心、肝胰腺、鰓、胃和腸組織中均有表達(dá)，qR

3、T-PCR分析其表達(dá)模式表明，對(duì)蝦受到鰻弧菌、金黃色葡萄球菌和白斑病毒的刺激后MjSWD在鰓和胃中表達(dá)量上調(diào)。純化的重組蛋白MjSWD可以通過(guò)結(jié)合細(xì)菌表面的肽聚糖結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌，并且可以抑制絲氨酸蛋白酶活性，如枯草桿菌蛋白酶A、蛋白酶K，還可以抑制細(xì)菌分泌的蛋白酶活性。與重組蛋白孵育過(guò)的鰻弧菌在自然感染的情況下對(duì)日本對(duì)蝦的感染能力明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明MjSWD在對(duì)蝦抗細(xì)菌免疫中發(fā)揮著重要的作用。
　　2.日本囊對(duì)蝦一種新

4、型抗脂多糖因子的功能研究
　　抗脂多糖因子(ALF)是甲殼動(dòng)物中具有廣譜抗菌活性的效應(yīng)分子，在對(duì)蝦中已發(fā)現(xiàn)四類抗脂多糖因子(ALF-A-ALF-B)。在日本囊對(duì)蝦中得到一類新型抗脂多糖因了，命名為MjALF-E。E組中含有兩條新型抗脂多糖因子，MjALF-E1和MjALF-E2。組織分布分析表明MjALF-E1主要在血細(xì)胞、心臟和小腸中高表達(dá)，而MjALF-E2主要表達(dá)在鰓、胃和小腸中，并且二者在受到細(xì)菌刺激后轉(zhuǎn)錄水平上都有所提高

5、。重組表達(dá)的重組蛋白 rMjALF-E2對(duì)細(xì)菌表而的多糖LPS和PGN表現(xiàn)出較弱的結(jié)合活性，人工合成的兩種抗脂多糖因子的LPS結(jié)合的結(jié)構(gòu)域多肽對(duì)細(xì)菌表面的多糖LPS和PGN有較強(qiáng)的結(jié)合活性。而且合成的多肽和重組表達(dá)的rMjALF-E2對(duì)革蘭氏陰性菌有抑制活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，MjALF-E2可以幫助體內(nèi)弧菌清除。通過(guò)RNA干擾的方式敲降MjALF-E2的表達(dá)，然后感染鰻弧菌，相對(duì)于對(duì)照組對(duì)蝦的累計(jì)死亡率明顯升高。綜上所述，MjALF-E2

6、在對(duì)蝦抵抗細(xì)菌侵染的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。
　　3.日本囊對(duì)蝦中具有抗病毒的抗脂多糖因子(MjALF-D2)的功能研究
　　抗脂多糖因子(ALF)的廣譜抗菌活性在很多甲殼動(dòng)物中都有報(bào)道，近幾年還發(fā)現(xiàn)其具有抗病毒活性，但具體的抗病毒機(jī)理還不清楚。在本研究中，構(gòu)建了日本囊對(duì)蝦的9種抗脂多糖因子的重組表達(dá)載體，進(jìn)行了重組表達(dá)與純化。將純化得到的重組蛋白與白斑綜合征病毒(WSSV)孵育注射到對(duì)蝦體內(nèi)，分析對(duì)蝦體內(nèi)WSSV的復(fù)制

7、，結(jié)果得到一種具有抗毒活性的抗脂多糖因子MjALF-D2。RT-PCR分析其在日本囊對(duì)蝦各組織中的表達(dá)情況，MjALF-D2在除肝胰腺外的各組織中均有所分布，在鰓和胃組織中表達(dá)量最高。白斑病毒刺激后不同時(shí)間段的表達(dá)模式分析結(jié)果表明，在受到病原刺激后MjALF-D2表達(dá)量明顯上調(diào)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:注射重組蛋白和白斑病毒的實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦體內(nèi)病毒的含量明顯低于對(duì)照組對(duì)蝦;相反的，通過(guò)注射雙鏈RNA將MjALF-D2干擾掉后，對(duì)蝦體內(nèi)的病毒復(fù)制率