BDNF-TrkB異常表達在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病中的作用及機理研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(MM)是骨髓內(nèi)異常漿細胞克隆性增殖性疾病。盡管近年來MM的基礎和臨床研究取得了長足的進展，但是迄今為止，MM仍然是不能根治的惡性血液系統(tǒng)疾病。深入探討MM發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機制，進行特異性、靶向性治療是血液病研究工作者面臨的挑戰(zhàn)。近年來研究表明骨髓微環(huán)境中的細胞因子及其介導的信號通路在骨髓瘤細胞的生長和存活中起重要作用，與骨髓瘤疾病的形成和惡化密切相關。前期研究發(fā)現(xiàn)MM患者血漿中BDNF高表達，而且BDNF表達水平與疾病進展程

2、度相關。為了進一步研究BDNF/TrkB與MM發(fā)生發(fā)展的關系，本實驗通過體外實驗和臨床標本的檢測初步研究了BDNF及其受體TrkB和p75NTR在骨髓瘤細胞系和骨髓瘤患者細胞中的表達；進而對BDNF的體內(nèi)外促血管新生作用進行了初步研究并進一步探討B(tài)DNF與MM誘導的血管新生的關系；并且通過體內(nèi)和體外實驗觀察BDNF對MM細胞增殖、遷移、侵襲和化療耐藥的作用；深入了解BDNF/TrkB信號參與MM的病理過程。 第一部分 腦

3、源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體在多發(fā)性骨髓瘤細胞中的表達 背景和目的：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，對中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)多種類型神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化和再生具有重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)BDNF通過激活其高親和力TrkB受體參與多種神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)系統(tǒng)實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤的發(fā)病機制中起重要作用。最新資料顯示，BDNF和/或其受體TrkB異常表

4、達也可見于血液系統(tǒng)腫瘤包括多發(fā)性骨髓瘤。前期實驗發(fā)現(xiàn)MM患者血漿中BDNF高表達，而且BDNF表達水平與疾病進展程度相關。本實驗通過體外實驗和臨床標本的檢測初步研究了BDNF和其受體在骨髓瘤細胞系和骨髓瘤患者中的表達，旨在探討B(tài)DNF/TrkB作為MM治療的新的靶分子的可行性。 方法：分離培養(yǎng)MM患者原代骨髓瘤細胞，RT-PCR法、Western-blot法分別檢測MM細胞系(HMCLs)RPMI8226、U266、KM3細胞和

5、原代骨髓瘤細胞BDNF及其受體TrkB和p75NTR在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達；ELISA法檢測HMCLsBDNF的分泌水平；免疫組織化學染色法檢測16例MM患者和9例對照骨髓活檢切片中BDNF及其受體TrkB的表達。 結果：RT-PCR結果表明12例MM患者原代漿細胞和HMCLsRPMI-8226、U266、KM3不僅表達BDNFmRNA，也表達其高親和力酪氨酸激酶受體TrkBmRNA；而正常人外周血B淋巴細胞不表達BDNF和

6、TrkBmRNA。Western-blotting分析證實HMCLs亦表達BDNF和TrkB蛋白，ELISA法檢測HMCLs上清液中BDNF蛋白的基礎分泌水平分別為(14.7±2.4)ng/ml、(8.2±1.3)ng/ml、(13.2±1.2)ng/ml，明顯高于正常人類血漿中BDNF(2.0±0.6)ng/ml的水平。骨髓活檢16例MM患者有12例瘤細胞BDNF陽性表達，15例TrkB陽性表達，表現(xiàn)為彌散的胞漿染色；而9例對照組正常

7、造血細胞僅有2例和4例弱陽性表達。在HMCLs、MM患者原代漿細胞和MM患者骨髓活檢切片中，RT-PCR、Westernblotting和免疫組化染色均未檢測到BDNF的低親和力受體p75NTR的表達。 結論：MM中存在著BDNF及其受體TrkB的異常表達，BDNF可能通過多種機制參與MM的病理生理過程，有望成為骨髓瘤治療的新靶點。 第二部分 BDNF對多發(fā)性骨髓瘤血管新生作用的研究 背景和目的：血管新生

8、參與多發(fā)性骨髓瘤(MM)的病理生理過程，與MM的發(fā)生發(fā)展和預后密切相關。骨髓瘤細胞可直接分泌多種作用于血管內(nèi)皮細胞的促血管新生因子，在骨髓瘤血管新生中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MM中存在著BDNF異常高表達，而且MM患者血清BDNF表達水平和一種重要的促血管新生因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)平行并有一定的相關性。最新資料顯示人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)、人腦血管內(nèi)皮細胞(HCEC)等多種內(nèi)皮細胞以及新生血管平滑肌細胞均能產(chǎn)生BDNF，并

9、且發(fā)現(xiàn)BDNF對血管內(nèi)皮細胞的生長發(fā)育起著重要的支持作用，推測BDNF可能在一定程度上參與了機體新生血管的形成。因此，本實驗對BDNF的體內(nèi)外促血管新生作用進行了初步研究并進一步探討人類多發(fā)性骨髓瘤細胞系BDNF的表達與MM誘導的血管新生的關系。 方法：分離并培養(yǎng)原代HUVEC，采用四唑鹽(MTT)比色法觀察BDNF對HUVEC增殖的作用，用改良的Boyden小室法和體外小管形成實驗等體外血管新生模型觀察不同濃度BDNF對HUV

10、EC遷移和形成血管通道的影響。體內(nèi)實驗采用雞胚尿囊膜血管生成實驗和小鼠Matrigelplug方法。制備KM3、RPMI-8826骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液，加或不加抗人類BDNF中和抗體，然后再分別用MTT法、改良的Boyden小室法和體外小管形成實驗觀察不同體積分數(shù)骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液對HUVEC增殖、遷移和分化的影響。 結果：BDNF對HUVEC的增殖沒有顯著作用，但可明顯促進HUVEC的遷移和管狀結構形成。BDNF以濃度依賴性

11、方式誘導HUVEC遷移，HUVEC的遷移指數(shù)25ng/mlBDNF為1.24±0.18，50ng/mlBDNF為1.56±0.23，100ng/mlBDNF為1.89±0.29，100ng/mlBDNF的遷移指數(shù)與25ng/mlVEGF相當。100ng/mlBDNF處理后，二維基質(zhì)膠中HUVEC形成完整的管狀結構，小管的直徑及面積均明顯高于對照組(P＜0.05)。BDNF亦可明顯促進小鼠Matrigelplug中血管新生和雞胚尿囊膜血管

12、生成。另一方面，KM3、RPMI8226培養(yǎng)上清液均可明顯促進HUVEC增殖，含50.0％KM3培養(yǎng)上清液組和完全KM3培養(yǎng)上清液組HUVEC數(shù)均明顯高于對照組(P＜0.05)，抗人類BDNF中和抗體可部分抑制其促增殖活性；MM細胞系培養(yǎng)上清液對HUVEC的遷移和分化亦有明顯的促進作用，含50.0％KM3培養(yǎng)上清液組HUVEC遷移指數(shù)為1.85±0.23(P＜0.05)，完全KM3培養(yǎng)上清液組HUVEC遷移指數(shù)為2.16±0.29(P＜

13、0.05)，并可明顯促進基質(zhì)膠中網(wǎng)狀毛細血管形成(P＜0.01)，抗BDNF中和抗體可明顯抑制其作用。 結論：BDNF在體內(nèi)外均具有明顯的促血管新生作用，可能為一種新的促血管新生因子；骨髓瘤細胞異常表達和分泌的BDNF可能參與骨髓瘤細胞誘導的血管新生。 第三部分 BDNF激活TrkB受體促進骨髓瘤細胞增殖和遷移的實驗研究 背景和目的：研究表明MM的轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在骨髓，骨髓微環(huán)境中的細胞因子及其介導的信號通

14、路在骨髓瘤細胞的生長和存活中起重要作用，與骨髓瘤疾病的形成和惡化密切相關。MM中存在著BDNF及其高親和力酪氨酸激酶受體TrkB的異常表達，近年來研究發(fā)現(xiàn)BDNF/TrkB在調(diào)控細胞增殖、生長、遷移和侵襲過程中起重要作用，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為此，本實驗對BDNF對MM細胞增殖遷移和化療保護的作用進行了初步研究，旨在探討B(tài)DNF/TrkB與MM發(fā)生發(fā)展的關系。方法：分離培養(yǎng)MM患者原代骨髓瘤細胞，采用臺盼藍拒染法檢測BDNF對H

15、MCLs(RPMI8226、U266、KM3)和原代MM細胞的存活促進作用，[3H]脫氧胸苷(3H-dTR)摻入法測定BDNF對MM細胞增殖的影響，用改良的Boyden小室法觀察BDNF對骨髓瘤細胞遷移和侵襲的影響，用MTT比色法觀察BDNF對馬法蘭和長春新堿細胞毒作用的影響，用Westernblotting檢測BDNF對MM細胞TrkB受體磷酸化的影響。動物模型觀察BDNF對腫瘤生長和存活時間的影響。結果：(1)BDNF以濃度依賴性方

16、式促進RPMI8226、U266、KM3細胞和原代MM細胞的存活和增殖。(2)BDNF可促進MM細胞的遷移和侵襲，BDNF對RPMI8226及KM3細胞具有明顯的遷移促進作用，12.5ng/ml～200ng/mlBDNF作用后遷移指數(shù)分別為1.63～3.11和1.92～3.76，其最大遷移活性分別在50ng/ml(P＜0.05)和25ng/ml(P＜0.01)時達到；而BDNF對U266的遷移僅有中等強度的促進作用，遷移指數(shù)為1.2～2

17、.1。(3)BDNF可明顯降低馬法蘭和長春新堿的細胞毒性，50ng/mlBDNF作用后，馬法蘭和長春新堿的EC50分別為無BDNF作用時的2倍和3倍。(4)BDNF可明顯促進異種移植的MM裸鼠模型中腫瘤的生長，增加腫塊的體積和重量，縮短裸鼠的生存時間。(5)MM細胞中異常表達的TrkB受體是BDNF的功能性受體，外源性BDNF作用后，MM細胞TrkB磷酸化水平明顯增加，并且Trk抑制劑K252a可明顯抑制BDNF誘導的MM細胞遷移。