兒童激素耐藥型腎病綜合征尿中差異表達(dá)蛋白的篩選和鑒定.pdf

1、腎病綜合征是以大量蛋白尿、低白蛋白血癥、高脂血癥和不同程度水腫為主要臨床特點(diǎn)的常見(jiàn)腎小球疾病。激素耐藥是腎病綜合征治療過(guò)程中遇到的棘手問(wèn)題，如何對(duì)激素耐藥型腎病綜合征(SRNS)極早期診斷以及及時(shí)制定治療方案為臨床所期望。 目前尿蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究，包括腎臟病學(xué)研究。但是尿蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于SRNS的極早期診斷尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究收集激素使用前的尿液用冷丙酮萃取方法提取尿蛋白，在激素足量規(guī)律治療8周后，根據(jù)激素治療效

2、應(yīng)分為激素耐藥和激素敏感兩組。用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選激素耐藥腎病綜合征尿中差異表達(dá)蛋白，對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，并挑選部分差異表達(dá)蛋白進(jìn)行初步驗(yàn)證。 §1腎病綜合征尿雙向電泳的建立及差異蛋白篩選 目的:建立兒童腎病綜合征尿蛋白組分析所需的固相pH梯度等電聚焦雙向電泳相關(guān)技術(shù)，并分析比較激素耐藥型腎病綜合征和激素敏感型腎病綜合征間差異，篩選出在激素耐藥型腎病綜合征表達(dá)中的差異蛋白點(diǎn)。 方法:冷丙酮

3、萃取腎病綜合征患兒尿蛋白，去除白蛋白等高豐度蛋白、除鹽，以固相IPGpH梯度等電聚焦為第一向，SDS均一膠(T=10﹪)的垂直電泳為第二向，銀染后用PDQuest軟件配比分析，篩選差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。 結(jié)果:成功獲得兒童腎病綜合征3尿蛋白雙向電泳圖譜。PDQuest7.3軟件進(jìn)行圖像分析，激素耐藥及激素敏感的3次凝膠的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為715士35和610士32。激素耐藥型腎病綜合征與激素敏感型蛋白圖譜相比，差異蛋白表達(dá)明顯的有1

4、9個(gè)蛋白點(diǎn)，14個(gè)出現(xiàn)上調(diào)，5個(gè)出現(xiàn)下調(diào)。 結(jié)論:對(duì)兒童腎病綜合征的尿液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究是可行的，可篩選到差異蛋白點(diǎn)，這為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。 §2差異蛋白的質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)初步分析 目的:對(duì)激素耐藥型腎病綜合征蛋白圖譜上差異明顯的19個(gè)蛋白點(diǎn)行質(zhì)譜鑒定，并對(duì)鑒定出的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)初步分析。 方法:對(duì)19個(gè)差異蛋白點(diǎn)胰酶酶切，質(zhì)譜分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖，通過(guò)相關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索分析，鑒定出蛋

5、白質(zhì)，將鑒定出蛋白質(zhì)輸入Harvester蛋白搜索框(http：//harvester.embl.de)和SWISS-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)可以得到相關(guān)蛋白生物信息學(xué)數(shù)據(jù)信息。 結(jié)果:19個(gè)激素耐藥的差異蛋白點(diǎn)經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜獲得了19張肽質(zhì)量指紋圖，進(jìn)入蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出12個(gè)蛋白質(zhì)分別是：驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員27(Kinesinfamilymember27)、磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)移蛋白(PITPNB)、大皰性類天皰瘡抗原1異構(gòu)體(Bul

6、louspemphigoidantigen)、α1蛋白酶抑制劑(Alpha-1proteaseinhibitor)、Zn-α2糖蛋白(Zn-alpha-2GP)、α1B糖蛋白(Alpha-1B-glycoprotein)、血清白蛋白前體(Serumalbuminprecursor)、結(jié)合珠蛋白前體(Haptoglobinprecursor)、類驅(qū)動(dòng)蛋白樣動(dòng)力蛋白(Kinesinlikemotorprotein)、白介素1受體相關(guān)激酶4(

7、IRAK4)、胞質(zhì)動(dòng)力蛋白(CytoplasmicDynein)、細(xì)胞角蛋白9(Cytokeratin9)。與激素敏感蛋白圖譜比較，在激素耐藥蛋白圖譜上Zn-alpha-2GP、Alpha-1B-glycoprotein出現(xiàn)下調(diào)，其余10種蛋白出現(xiàn)上調(diào)。12種蛋白質(zhì)在SWISS-Prot和EMBL(Harvester)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，獲得蛋白質(zhì)鑒定和識(shí)別、相似性分析、模式查詢、翻譯后預(yù)測(cè)、一級(jí)結(jié)構(gòu)分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)等

8、相關(guān)數(shù)據(jù)。 結(jié)論:這些差異蛋白的檢測(cè)有利于對(duì)激素耐藥型腎病的極早期診斷，而對(duì)這某些差異蛋白進(jìn)一步研究分析，也有可能有助于了解腎病綜合征激素耐藥機(jī)制。 §3IRAK-4和CytoplasmicDynein差異蛋白表達(dá)的初步驗(yàn)證 目的:驗(yàn)證IRAK-4和CytoplasmicDynein差異蛋白在患兒尿液中的表達(dá)水平。 方法:對(duì)激素耐藥型和激素敏感型腎病患兒尿液用WesternBlot檢測(cè)IRAK-4和Cy

9、toplasmicDynein變化情況。 結(jié)果:IRAK-4在激素敏感腎病尿液中低表達(dá)，激素耐藥尿液中高表達(dá)。CytoplasmicDynein在激素敏感腎病尿液中低表達(dá)，激素耐藥尿液中高表達(dá)。 結(jié)論:IRAK-4和CytoplasmicDynein差異蛋白表達(dá)與雙向電泳結(jié)果變化一致，提示本研究中差異蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較好的可靠性。對(duì)腎病綜合征初治患兒尿液IRAK-4和CytoplasmicDynein差異蛋白檢測(cè)可對(duì)激

10、素耐藥極早期判斷。 §4IRAK4在正常尿液與正常腎組織中的進(jìn)一步驗(yàn)證 目的:比較正常尿液與激素耐藥雙向電泳圖譜，研究這些差異蛋白在正常尿液中是否有表達(dá)。 方法:對(duì)正常尿液進(jìn)行雙向電泳，PDQuest軟件對(duì)激素耐藥和正常尿液蛋白雙向電泳圖譜進(jìn)行配比分析，分析這些差異蛋白點(diǎn)在正常尿液中的表達(dá)情況，并應(yīng)用免疫組化方法對(duì)IRAK4差異蛋白在人的腎臟組織中進(jìn)行定位。 結(jié)果;配比分析結(jié)果顯示：Serumalbumi

11、nprecursor、Zn-alpha-2GP和Alpha-1B-glycoprotein在正常尿液中有匹配蛋白點(diǎn)，在SRNS中出現(xiàn)的其余9種蛋白均無(wú)匹配蛋白點(diǎn)。IRAK4免疫組化結(jié)果顯示：IRAK4僅在人腎臟遠(yuǎn)曲小管有表達(dá)。 結(jié)論:(1)這些差異蛋白在激素耐藥尿液雙向電泳圖譜中出現(xiàn)有可能對(duì)激素耐藥極早期診斷有益。(2)腎病綜合征中遠(yuǎn)曲小管的損傷對(duì)耐藥的發(fā)生可能有重要的影響。 本課題的創(chuàng)新之處在于：(1)首次應(yīng)用尿蛋白

12、質(zhì)組學(xué)的方法篩選激素耐藥型腎病綜合征與激素敏感型腎病綜合征激素使用前的尿中差異蛋白，并篩選出12個(gè)差異蛋白，其中胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白有8種，分別是：驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員27(Kinesinfamilymember27)、磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)移蛋白(PITPNB)、大皰性類天皰瘡抗原1異構(gòu)體(Bullouspemphigoidantigen)、α1蛋白酶抑制劑(Alpha-1proteaseinhibitor)、類驅(qū)動(dòng)蛋白樣動(dòng)力蛋白(Kinesinlike

13、motorprotein)、白介素1受體相關(guān)激酶4(IRAK4)、胞質(zhì)動(dòng)力蛋白(CytoplasmicDynein)和細(xì)胞角蛋白9(Cytokeratin9)。分泌性蛋白有4種，分別是Zn-α2糖蛋白(Zn-alpha-2GP)、α1B糖蛋白(Alpha-1B-glycoprotein)、血清白蛋白前體(Serumalbuminprecursor)和結(jié)合珠蛋白前體(Haptoglobinprecursor)。這12個(gè)差異蛋白均可作為激素

14、耐藥極早期的判斷指標(biāo)。(2)本研究通過(guò)尿蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選到激素運(yùn)輸?shù)膭?dòng)力蛋白Dynein，Westernblot結(jié)果提示：Dynein在激素耐藥尿液中高表達(dá)，在尿液中出現(xiàn)這種胞漿蛋白，推測(cè)細(xì)胞完整性可能遭到破壞，Dynein丟失導(dǎo)致與激素結(jié)合減少，可能是導(dǎo)致激素耐藥的原因之一，對(duì)Dynein深入研究有可能為激素耐藥機(jī)制方面研究提供一個(gè)新的思路。(3)IRAK-4差異蛋白免疫組化結(jié)果顯示：IRAK-4僅在人腎組織遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞胞漿中表達(dá)，