LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的基質(zhì)細胞再編程調(diào)控角膜抗真菌天然免疫的分子機制.pdf

1、真菌性角膜炎(fungalkeratitis，F(xiàn)K)是最嚴重的眼部感染性疾病之一，治療不當(dāng)迅速惡化，數(shù)天內(nèi)即可導(dǎo)致失明。誘發(fā)角膜真菌感染首要的原因在發(fā)展中國家為角膜創(chuàng)傷，在發(fā)達國家則為角膜接觸鏡的配戴。濕熱的氣候是所有地區(qū)的高危致病因素。鐮刀菌和曲霉菌是真菌性角膜炎最常見的病原體。正常情況下，角膜對真菌感染有很強的抵抗力，當(dāng)角膜上皮完整性遭到破壞，暴露其下方角膜基質(zhì)層時，才會發(fā)生真菌性角膜炎。角膜基質(zhì)細胞是角膜天然免疫防御體系的第二道屏

2、障，參與真菌的快速識別、抵抗真菌入侵。
　　Toll樣受體(Tolllikereceptors，TLRs)是天然免疫的關(guān)鍵模式識別受體，通過識別微生物的固有成分病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)發(fā)揮重要作用。多種TLRs在角膜基質(zhì)細胞的胞膜上或胞質(zhì)內(nèi)都有表達，其中TLR4的特異性配體為脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，TLR2則能夠識別來源

3、于革蘭氏陰性和陽性細菌的多種脂肽和脂蛋白成分。我們前期研究發(fā)現(xiàn)TLR2及TLR4是角膜啟動抗真菌天然免疫的主要受體，在煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus，AF)角膜炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮決定性作用。TLR2、4的活化能激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而介導(dǎo)炎性因子的分泌，趨化炎癥細胞向角膜基質(zhì)層遷移，同時誘導(dǎo)抗菌因子產(chǎn)生，殺滅和清除致病原。然而，過度的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致組織損傷和破壞，誘發(fā)角膜穿孔或視力喪失，TLRs介導(dǎo)的角膜抗真菌

4、免疫反應(yīng)必須控制在適度范圍內(nèi)。
　　TLRs通過與接頭蛋白分子髓樣分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88，Myd88)和TIR結(jié)構(gòu)域接頭分子(Toll-IL-1receptordomain-containingadaptorinducinginterferon-beta，TRIF)結(jié)合激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。TLRs的炎癥損傷效應(yīng)主要與Myd88依賴的經(jīng)典途徑和Myd88依賴的促分裂素原活化蛋

5、白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)途徑有關(guān)，二者通過活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactorκB，NF-κB)和激活蛋白-1（activatorprotein-1，AP-1），介導(dǎo)多種炎性細胞因子和趨化因子，如白介素(interleukin，IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)-α等的分泌。與之相反，MyD88非依賴的TRIF途徑能激活

6、轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子(interferonregulatoryfactor,IRF)-3，從而調(diào)節(jié)干擾素(interferon，IFN)-β和其他抗炎介質(zhì)的表達。因此，TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系中存在著損傷與保護的微妙平衡，一旦打破將對角膜抗真菌天然免疫反應(yīng)產(chǎn)生嚴重的影響。
　　我們的前期研究證明，小劑量的LPS預(yù)處理能夠誘導(dǎo)永生化人角膜基質(zhì)細胞（telomerase-immortalizedhumanstromafibroblas

7、ts，THSFs）再編程，調(diào)控角膜抗煙曲霉菌天然免疫反應(yīng)。小劑量LPS預(yù)處理THSFs一定時間后再用煙曲霉菌刺激，炎性細胞因子IL-6和IL-8的分泌量減少，抗菌肽CCL20和Tβ4的表達增加，多形核白細胞（polymorphonuclearleukocyte，PMN）的遷移受到抑制。所以，LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細胞再編程為真菌感染提供了一種保護性機制，在避免過度角膜炎癥反應(yīng)的同時增強角膜先天抗感染能力。
　　但是，關(guān)于LPS

8、預(yù)處理誘導(dǎo)的煙曲霉菌刺激角膜基質(zhì)細胞再編程的作用機制目前尚不明確。我們用小劑量LPS預(yù)處理12h后，再用大劑量煙曲霉菌刺激THSFs，觀察TLR4、TLR2mRNA水平的變化，利用TLR4、2的特異性中和抗體進一步明確TLRs在角膜基質(zhì)細胞再編程中的作用;繼而研究了LPS預(yù)處理對TLRs下游Myd88依賴的經(jīng)典途徑、Myd88依賴的MAPK途徑以及MyD88非依賴的TRIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。探索脂多糖預(yù)處理誘導(dǎo)的基質(zhì)細胞再編程調(diào)控角膜

9、抗真菌天然免疫的分子機制，將為合理調(diào)控抗真菌炎癥反應(yīng)、避免角膜組織損傷與破壞以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重建提供新的靶點和理論依據(jù)。
　　第一部分TLR4介導(dǎo)LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細胞再編程
　　[目的]
　　研究煙曲霉菌刺激下脂多糖預(yù)處理引起的角膜基質(zhì)細胞再編程中的關(guān)鍵受體。
　　[方法]
　　1.AF菌種和菌絲的制備:AF菌株CCTCC93024購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。將菌種接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，37

10、℃條件下200轉(zhuǎn)每分鐘（revolutionperminute，rpm）搖床培養(yǎng)24h。收集孢子以108個/ml的終濃度接種于沙氏液體培養(yǎng)基，接種的試管26℃、500rpm搖床培養(yǎng)18h后1000×g離心10min。得到的AF菌絲體漂洗2次后懸浮于Dulbecco'sHanks平衡鹽溶液(Dulbecco'sHanksbalancedsaltsolution，D-Hanks)中，56℃加熱60min滅活。然后Potter-Elvehje

11、m組織勻漿器將菌絲研磨成20～40μm長的片段，濃度調(diào)整為1×106個菌絲體片段/ml，制成AF抗原刺激液。
　　2.細胞的培養(yǎng):THSFs由Fu-ShinX.Yu教授和IleneK.Gipson教授慷慨提供。細胞在37℃、5％CO2的濕潤條件下用含10％新生牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium，DMEM)培養(yǎng)。細胞以4×105個/孔的濃度接種于6孔微培養(yǎng)板并生長至80％融合

12、（2天左右），不含血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓16h后用于刺激試驗。
　　3.細胞的刺激和耐受的誘導(dǎo):THSF細胞經(jīng)LPS(10ng/ml)預(yù)處理12h后用不含血清的培養(yǎng)基沖洗2次，給予AF菌絲（106個/ml）再次刺激。第2次刺激后不同時間點(30min，1h，3h，6h)收取細胞，熒光定量實時聚合酶鏈反應(yīng)(realtime-polymerasechainreaction，RT-PCR)檢測TLR4mRNA的水平，或于第2次刺激后4

13、h收取細胞及細胞上清，RT-PCR檢測TLR2的基因表達，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）檢測IL-6、IL-8和TNF-α的分泌。
　　4.抗體中和能力的測定和受體封閉實驗:利用TLR2和TLR4的單克隆抗體孵育THSFs進行受體封閉試驗。THSF細胞與抗人TLR4(100ug/ml)、抗人TLR2(100ug/ml)或抗人TLR4(100ug/ml)+TLR2(10

14、0ug/ml)單克隆抗體共孵育30min后，37℃條件下酵母聚糖(1mg/ml)或LPS（1μg/ml）刺激12h，或LPS(10ng/ml)預(yù)處理12h后AF菌絲（106個/ml）再次刺激4h。收取細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液，ELISA檢測IL-6、IL-8、TNF-α的分泌或RT-PCR檢測TLR2的表達。
　　[結(jié)果]
　　1.單克隆抗體可有效封閉TLR2及TLR4:TLR2、4抗體對THSF中IL-8和TNF-α的基礎(chǔ)

15、分泌沒有影響，TLR2配體酵母聚糖或TLR4配體脂多糖均刺激THSF細胞高表達IL-8和TNF-α，中和性抗體封閉相應(yīng)TLR后這種刺激作用消失，抗體封閉組與空白對照組的炎性因子分泌量無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。因此，我們使用的特異性單克隆抗體能夠有效的阻斷相應(yīng)TLRs的功能。
　　2.LPS預(yù)處理對大劑量AF誘導(dǎo)的TLR4表達的影響:為了研究THSF細胞中LPS預(yù)處理對TLR4水平的調(diào)節(jié)作用，10ng/ml的LPS預(yù)處理12h后，煙曲霉菌菌

16、絲再次刺激THSF，RT-PCR檢測TLR4的表達。結(jié)果顯示第二次刺激1小時、3小時后LPS預(yù)處理組TLR4mRNA的表達量均低于單純AF刺激組。
　　3.LPS預(yù)處理對煙曲霉菌刺激角膜基質(zhì)細胞炎性因子分泌的抑制作用依賴于TLR4的功能:在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，10ng/mlLPS預(yù)處理能減少再次煙曲霉菌刺激誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細胞IL-6和IL-8的分泌。在此我們進一步探討這種炎性細胞因子表達的抑制現(xiàn)象是否依賴于TLR4的作用。在LPS

17、預(yù)處理之前封閉TLR4，培養(yǎng)上清中IL-6、IL-8和TNF-α的含量較未封閉TLR4的LPS預(yù)處理組增加，與未封閉TLR4的無預(yù)處理煙曲霉菌刺激組之間沒有明顯差異。
　　4.TLR2在LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細胞再編程中的作用研究:實時熒光定量PCR檢測TLR2的表達，結(jié)果顯示LPS預(yù)處理對煙曲霉菌誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細胞中TLR2mRNA的水平?jīng)]有明顯影響。雖然TLR4單克隆抗體對TLR2的基礎(chǔ)表達沒有刺激作用，但預(yù)處理前封閉TL

18、R4，THSF細胞中煙曲霉菌刺激的TLR2表達明顯上調(diào)。LPS預(yù)處理前利用特異性抗體將TLR2與TLR4共同封閉，IL-6、IL-8和TNF-α的分泌較無預(yù)處理對照組明顯下降，接近基礎(chǔ)分泌水平。
　　[結(jié)論]
　　1.在角膜基質(zhì)細胞再編程中，TLR4作為關(guān)鍵的受體，能特異性的介導(dǎo)LPS預(yù)處理引起的炎性細胞因子抑制。
　　2.LPS預(yù)處理對煙曲霉菌誘導(dǎo)的TLR2表達沒有明顯影響，但是封閉TLR4后TLR2是維持炎性細胞因

19、子分泌水平的關(guān)鍵因素。
　　第二部分LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細胞再編程對TLR4下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控
　　[目的]
　　研究THSF細胞中LPS預(yù)處理對TLR4下游Myd88依賴的經(jīng)典途徑、Myd88依賴的MAPK途徑以及MyD88非依賴的TRIF途徑的影響。
　　[方法]
　　用小劑量LPS預(yù)處理12h后，再用大劑量AF刺激THSF，培養(yǎng)0.5、1、3、6、12小時分別收取細胞及培養(yǎng)上清，RT-PCR

20、、ELISA及wensternblot檢測Myd88依賴的經(jīng)典途徑的關(guān)鍵因子MyD88、IκB-α、NF-Kb-p65，Myd88依賴的MAPK途徑的關(guān)鍵因子MAPK3、AP-1、ERK1/2以及Myd88非依賴的TRIF途徑的關(guān)鍵因子TRIF、IRF-3、IFN-β的基因和蛋白水平;細胞免疫熒光檢測轉(zhuǎn)錄因子NF-Kb-p65向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
　　[結(jié)果]
　　1.Myd88依賴的經(jīng)典途徑的抑制:RT-PCR結(jié)果顯示煙曲霉

21、菌再次刺激1小時、3小時后LPS預(yù)處理組MyD88mRNA的表達低于非預(yù)處理組;IκB-αmRNA及蛋白的表達高于非預(yù)處理組，間接說明1小時、3小時LPS預(yù)處理組NF-κB的表達低于非預(yù)處理組;NF-κB-p65的蛋白表達低于非預(yù)處理組，向胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移也受到抑制。
　　2.Myd88依賴的MAPK途徑下游信號因子的表達下調(diào):1小時、3小時LPS預(yù)處理組MAPK3、AP-1mRNA的表達均低于非預(yù)處理組，westernblot結(jié)果顯

22、示1小時、3小時ERK1/2的蛋白表達量預(yù)處理組也明顯低于無預(yù)處理組。
　　3.Myd88非依賴的TRIF途徑下游信號因子表達和細胞因子分泌上調(diào):LPS預(yù)處理后再用煙曲霉菌菌絲刺激THSF細胞，RT-PCR結(jié)果顯示真菌刺激3小時、6小時后TRIF、IRF3、IFN-βmRNA的表達增加，而LPS預(yù)處理組TRIF途徑關(guān)鍵信號因子的水平較無預(yù)處理組進一步升高。IFN-β的ELISA檢測顯示了一致的結(jié)果。
　　[結(jié)論]